利用RNA干擾技術(shù)提高番茄抗TMV侵染能力的研究.pdf

1、煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）是RNA病毒的一種，主要侵染煙草及其他茄科植物，在寄主體內(nèi)完全寄生性生存，侵染植物危害嚴重，尤其是嚴重威脅栽培作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。番茄病毒病害在番茄生產(chǎn)栽培中危害較大，在我國大部分番茄栽培區(qū)內(nèi)普遍發(fā)生。煙草花葉病毒就是其主要病毒病原這一。生產(chǎn)中普遍采用的防治手段是選育抗病品種，常規(guī)的雜交育種培育抗病品種存在一定的局限性，而 RNA干擾（RNA interference，RNA

2、i）技術(shù)作為一種分子生物學手段為植物病毒病害防治開辟了一條新途徑。
　　基于 RNAi機制，以TMV復制酶基因（TMV-replicase，TMV-r）為 RNAi的靶向基因，在NCBI網(wǎng)站對靶向基因進行序列同源性比對，確定RNAi的靶標序列，設(shè)計上下游引物，經(jīng)RT-PCR從感染TMV病毒的煙草葉片中克隆靶向基因的靶序列片段。借助限制性內(nèi)切酶將靶序列正向、反向構(gòu)建到含35S超強啟動子的RNAi表達載體相應(yīng)克隆位點，特異引物PCR反

3、應(yīng)及酶切反應(yīng)檢測載體構(gòu)建結(jié)構(gòu)正確。經(jīng)凍融法將表達載體重組質(zhì)粒導入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，完成雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建。經(jīng)葉盤法侵染番茄無菌苗，結(jié)合組織培養(yǎng)及激素誘導，通過抗生素選擇性培養(yǎng)基篩選出9株番茄轉(zhuǎn)化苗，繼續(xù)培育后經(jīng)特異引物PCR和NOS終止子引物PCR檢測，確定3株為RNAi轉(zhuǎn)基因番茄苗。對轉(zhuǎn)基因番茄人工接種TMV病毒并調(diào)查感病進展。結(jié)果表明：與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗严啾?，轉(zhuǎn)基因番茄對TMV的抗病能力顯著提高，兩株達到顯著抗病水平。選取表現(xiàn)