抗馬鈴薯Y病毒RNA干擾載體的構(gòu)建及瞬時表達分析.pdf

1、馬鈴薯病毒性病害是導致馬鈴薯產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣的主要原因之一，可導致馬鈴薯的利用價值大大降低，已給世界和我國造成了嚴重的損失。目前，利用RNAi(RNA inference,RNAi)技術(shù)進行的抗病毒基因工程是抗馬鈴薯病毒的有效手段之一。
　　RNAi是生物體（植物、動物和真菌等）中一種同源性依賴降解特定mRNA的保護機制。RNA介導的抗病毒最有效的策略是通過構(gòu)建病毒特定基因片段反向重復序列載體轉(zhuǎn)入植物中，轉(zhuǎn)錄后生成RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)

2、(hairpin-RNA,hpRNA)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的柄可誘導轉(zhuǎn)錄后沉默過程(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)過程，實現(xiàn)抗病毒目的。因此，構(gòu)建hpRNA高效表達載體對成功利用RNAi技術(shù)培育抗病毒轉(zhuǎn)基因作物起著至關(guān)重要的作用。
　　本研究主要包括兩個部分內(nèi)容，介紹如下：
　　第一部分為貴州不同地區(qū)馬鈴薯Y病毒(potato virus Y,PVY)外殼蛋白（coat protei

3、n,CP）基因的克隆及遺傳分析，這是馬鈴薯抗病毒基因工程重要的前期工作。從中國貴州不同地區(qū)采集感染馬鈴薯Y病毒(PVY)病害葉片，利用試管捕捉RT-PCR(the tube capture RT-PCR,TC-RT-PCR)方法克隆到長度為804bp的8個目的片段，序列分析表明為PVY外殼蛋白(PVY-CP)基因。通過與已經(jīng)發(fā)表的PVY-CP基因序列進行比較和遺傳分析，得出如下結(jié)論:
　　1)通過CP基因進行序列分析，可以明確的將

4、PVY三個株系區(qū)分開來，說明利用CP基因去分類PVY是可靠的。
　　2)通過系統(tǒng)樹將本研究分離的PVY，7株鑒定為O株系，1株鑒定為NTN株系，并說明PVYO可能是貴州地區(qū)普遍存在的PVY類群。
　　3)對已報道的PVYO和PVYN進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)兩個株系間有較大的序列差異，并發(fā)現(xiàn)5‘端差異非常明顯，3’端比較保守。同源性分析給予RNAi抗病毒基因工程的靶基因片段的選擇一定的指導性，是重要的前期工作。
　　第二部分

5、主要是探索PVY-CP基因片段的同源性、位置和大小因素對抗病性影響。根據(jù)PVY不同株系CP基因同源性差異，設(shè)計了不同大小片段干涉載體，通過瞬時表達分析探索這些載體的抗病毒效率，得出如下結(jié)論：
　　1)用于研究同源性的干涉載體pH-Y100-390、pH-Y246-508和pH-Y23-260，研究位置影響的干涉載體pH-Y451-750和pH-Y246-508都獲得較高的抗病性，差異不明顯。
　　2)通過對選擇片段大小不同的

6、載體pH-Y246-508、pH-Y330-528、pH-Y386-528和pH-Y404-507的抗病性的研究，發(fā)現(xiàn)選擇片段為104bp的載體pH-Y404-507出現(xiàn)抗病性明顯降低的現(xiàn)象，而其他三個載體都獲得了100％抗病率。因此，本研究初步將將能引起高效抗性的最短片段定位到104-143bp之間，這為進一步的研究多抗轉(zhuǎn)基因研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
　　3)通過以pHellsgate12和pROKII為基礎(chǔ)構(gòu)建的PVY干涉載