利用RNAi技術創(chuàng)建無標記基因的抗病毒轉基因水稻.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一,占我國糧食生產和消費的40％,在糧食安全和國民經濟中占有舉足輕重的作用。由水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻條紋葉枯病是我國粳稻種植區(qū)最重要的水稻病毒病害。流行年份,一般田塊減產20％～30％,嚴重田塊達80％以上,甚至顆粒無收。近幾年,由水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)引起的水稻黑條矮縮病再度爆發(fā)流行,一般

2、田塊發(fā)病株率10～30％,嚴重田塊可高達40～80％以上。在田間這兩種病毒病常常混合發(fā)生、危害巨大。對于病毒病而言,最為經濟有效的防治途徑是利用品種自身的抗性達到主動控治病害的目的,然而傳統(tǒng)的育種獲得兼抗兩種病毒病、高產、優(yōu)質品種的難度極大。本研究采用轉基因技術,首先構建含兩種病毒保守序列的RNA干擾(RNAinterference,RNAi)載體,進而利用農桿菌介導轉化水稻成熟胚愈傷組織,通過組織培養(yǎng)獲得轉基因再生植株,并初步進行了分

3、子檢測和抗病性鑒定,主要結果如下:
　　 1、分別克隆了RSV和RBSDV外殼蛋白(Coat protein,CP)基因的部分核苷酸片段(RSV—HCP、RBSDV—HS10),并獲得二者的串聯片段DR。利用RNA干涉載體pMCG161上的多克隆酶切位點,分別將RSV—HCP、RBSDV—HS10和DR正向、負向插入,從而形成發(fā)夾結構,獲得的干涉載體分別命名為pMCG161+／-R、pMCG161+／-B和pMCG161+／-D

4、。由于上述干涉載體攜帶有氯霉素抗性基因,不適合農桿菌介導法的遺傳轉化,因此再分別將上述3個干涉載體上的發(fā)夾結構連接到適合農桿菌介導法轉化,且不含潮霉素(hpt)抗性基因的載體pCAMBIA1301-hpt-上,獲得了3個不含抗生素標記基因的RNAi載體,分別命名為pCAMBIA1301+／-R、pCAMBIA1301+／-B和pCAMBIA1301+／-D。
　　 2、采用雙菌株、雙質粒共轉化的方法,將攜帶hpt抗性基因的pCA

5、MBIA1301質粒和不攜帶hpt抗性基因的pCAMBIA1301+／-R、pCAMBIA1301+／-B和pCAMBIA1301+／-D質粒分別電擊轉化到農桿菌超毒力菌株EHA105中,通過遺傳轉化將兩個獨立的分別攜帶目的基因和hpt抗性基因的T—DNA區(qū)共整合到水稻模式品種愛知旭的基因組中,目的是既可以在T0代通過抗生素進行抗性愈傷的篩選,又可以通過轉基因再生植株后代分離,獲得不含標記基因的抗病毒材料。
　　 3、在農桿菌E

6、HA105的介導下,將上述載體分別導入水稻品種愛知旭的成熟胚愈傷組織中,經潮霉素篩選,獲得轉雙價載體pCAMBIA1301+／-D的抗性愈傷組織514個,分化得到447株再生植株；獲得轉單價載體pCAMBIA1301+／-R的抗性愈傷組織202個,分化得到再生植株139株;轉單價載體pCAMBIA1301+／-B的抗性愈傷組織179個,分化得到105株再生植株。
　　 4、對256株轉雙價載體pCAMBIA1301+／-D的T0

7、代植株進行檢測時,常規(guī)的PCR體系僅檢測到46株含目的基因的陽性植株,共轉化率為16.8％,與大多數報道的雙菌雙質粒介導的共轉化率相近。應用本研究建立的巢式PCR體系,447株可檢測出陽性植株148株,共轉化率上升到33.3％,說明在雙菌雙質粒介導的共轉化體系中共轉化率可能會因檢測體系靈敏度的提高而提高。
　　 5、將轉基因T0代幼苗移栽到RSV重發(fā)區(qū)河南鄭州,選擇田間自然發(fā)病嚴重的田快,通過自然發(fā)病進行了抗病性評價,移栽30～

8、35天后的調查結果表明:轉化載體pCMBIA1301+／-D的植株88棵中,其中8株未表現癥狀(0級),34株表現輕微癥狀(Ⅰ級),29株表現中等癥狀(Ⅱ級),10株嚴重癥狀(Ⅲ),7株極嚴重癥狀(Ⅳ)。但受體發(fā)病嚴重,全部為Ⅲ或Ⅳ級,發(fā)病株率為100％,結果表明:盡管轉基因水稻不同株系間存在明顯的抗病性差異,但總體來看,轉基因水稻T0代植株的長勢明顯優(yōu)于非轉基因受體植株,可以篩選到高抗RSV的株系。目前正在江蘇省建湖縣和姜堰縣分別對T