高溫對(duì)抗病毒RNA沉默及轉(zhuǎn)基因RNA沉默的影響.pdf

1、植物的病毒抗性受到外界環(huán)境的影響，高溫可以激活植物體對(duì)病毒的防御機(jī)制，使植物體的病毒癥狀緩和或完全消失。該現(xiàn)象很早已被發(fā)現(xiàn)并在很多文章中闡述，然而其具體的分子機(jī)制仍不是十分明確。本研究利用心葉煙和本生煙兩種植物材料，探討了PVX、PVYN病毒誘導(dǎo)的RNA沉默以及瞬時(shí)侵染GFP誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因RNA沉默受溫度影響的基本規(guī)律和分子機(jī)制，以下是具體研究結(jié)果。
　　 （1）30℃持續(xù)處理PVX和PVYN發(fā)病植株（熱恢復(fù)試驗(yàn)）表明，處理后植株

2、上部新生葉片癥狀逐步減輕，12天后癥狀完全消失，ELISA檢測(cè)病毒含量接近健康水平，下部老葉片雖保持發(fā)病癥狀，但病毒含量也持續(xù)下降。這說(shuō)明高溫能增強(qiáng)心葉煙抗病毒RNA沉默。植株上部葉片是否表現(xiàn)癥狀取決于病毒復(fù)制擴(kuò)散與病毒RNA同源降解之間的平衡,22℃條件下，雖然植物體也會(huì)發(fā)生病毒誘導(dǎo)的RNA沉默，但不足以阻止病毒由發(fā)病葉片向新生葉片的擴(kuò)散，最終導(dǎo)致整株發(fā)病；而高溫條件下，發(fā)病區(qū)病毒含量下降，同時(shí)由于上部葉片RNA沉默增強(qiáng)，迅速將自下而

3、上擴(kuò)散的病毒降解，使上部葉片維持無(wú)癥狀態(tài)。當(dāng)癥狀恢復(fù)植株置于22℃條件時(shí)，上部葉片會(huì)重新發(fā)病，這說(shuō)明RNA沉默與病毒擴(kuò)散始終處于動(dòng)態(tài)抗衡中。這一研究結(jié)果提示，如果RNA沉默達(dá)到足夠的強(qiáng)度，寄主就能高抗病毒甚至完全不發(fā)病。
　　 （2）心葉煙病毒熱恢復(fù)試驗(yàn)表明，參與抗病毒RNA沉默的RDR1、RDR6以不同的方式響應(yīng)了這一過(guò)程。Northern blot結(jié)果顯示，響應(yīng)脅迫并具有水楊酸誘導(dǎo)特點(diǎn)的RDR1，其mRNA在30℃高溫下逐漸

4、積累，12天時(shí)達(dá)到最高豐度，此時(shí)上部葉片已無(wú)癥狀，而且上部葉片RDR1表達(dá)水平明顯高于下部葉片，因此推測(cè)RDR1很可能參與了高溫激活的病毒防御。與健康植株相比，PVX和PVYN發(fā)病植株中RDR1 mRNA的積累并未受到病毒顯著影響，這說(shuō)明RDR1很可能直接響應(yīng)高溫而并非受病毒誘導(dǎo)。另一種參與病毒介導(dǎo)RNA沉默的RNA依賴的RNA聚合酶RDR6，在健康植株中的表達(dá)量遠(yuǎn)低于RDR1，而且其表達(dá)量在健康植株和感病植株中均表現(xiàn)為不受溫度影響。R

5、DR6 mRNA的積累量與PVX病毒積累量成明顯正相關(guān)，植株下部發(fā)病葉片及有癥狀的上部葉片均維持較高水平的RDR6 mRNA，當(dāng)上部葉片癥狀恢復(fù)，PVX含量下降至健康水平時(shí)，RDR6的表達(dá)隨之下降到本底水平，因此推測(cè)在侵染PVX的植株中，RDR6通過(guò)響應(yīng)寄主細(xì)胞中的病毒含量參與寄主的抗病毒RNA沉默。而PVYN 感病植株的RDR6卻不受病毒的影響，基本維持與健康植株相似的本底水平的表達(dá)，因此參與PVYN介導(dǎo)的抗病毒RNA沉默途徑的RNA

6、依賴的RNA聚合酶以RDR1為主，RDR6起輔助作用或不起作用。這說(shuō)明不同病毒誘導(dǎo)的抗病毒RNA沉默可能涉及不同的RNA依賴的RNA聚合酶。
　　 （3）心葉煙熱恢復(fù)試驗(yàn)中，癥狀一直維持的下部葉片在高溫處理過(guò)程中均能檢測(cè)到病毒來(lái)源的siRNA，積累量隨處理時(shí)間增加并沒(méi)有明顯變化，而上部葉片siRNA隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，癥狀減輕，病毒含量下降，病毒來(lái)源的siRNA減少到檢測(cè)不到的水平（PVX，PVYN侵染植株分別在處理6天和9天時(shí)）

7、。這與在本生煙或心葉煙的瞬時(shí)侵染試驗(yàn)由轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的RNA沉默中隨著沉默增強(qiáng)siRNA積累水平增加的規(guī)律不一致，因此病毒siRNA的積累水平可能對(duì)應(yīng)于被降解的病毒RNA量，也就是說(shuō)siRNA在病毒侵染植株中的積累量不能準(zhǔn)確反映植物的抗病毒RNA沉默活性。
　　 （4）具有廣譜抗性的病程相關(guān)蛋白對(duì)高溫恢復(fù)處理也有一定響應(yīng)。心葉煙健康植株高溫持續(xù)處理后，下部葉片PR1逐漸積累，而上部新生葉片PR1一直表達(dá)微弱，似乎不受溫度影響。而發(fā)病

8、株P(guān)R1的表達(dá)明顯高于健康植株，經(jīng)高溫處理后上部葉片PR1的表達(dá)隨癥狀減輕而下降，下部葉片PR1表達(dá)量也略有降低。這說(shuō)明PR1蛋白對(duì)病毒侵染和高溫均產(chǎn)生響應(yīng)，因此很可能也參與了高溫激活的病毒防御反應(yīng)。PVYN病毒恢復(fù)試驗(yàn)中，PR1 mRNA的積累增加趨勢(shì)明顯早于健康植株，這很可能是病毒侵染和高溫雙重因素誘導(dǎo)的疊加效應(yīng)。但病程相關(guān)蛋白是通過(guò)介入RNA沉默途徑起作用還是直接參與抗病毒反應(yīng)尚需進(jìn)一步探討。
　　 （5）心葉煙30℃高溫

9、預(yù)處理后接種PVX病毒，并置于22℃繼續(xù)生長(zhǎng)觀察發(fā)病情況。結(jié)果表明，高溫預(yù)處理1-4天的心葉煙，接毒7天后上部葉片表現(xiàn)明顯癥狀，而隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，接毒7天后的癥狀逐漸減輕，預(yù)處理12天的心葉煙在接毒7天后已觀察不到任何癥狀，ELISA檢測(cè)病毒含量接近健康水平。這說(shuō)明在病毒不存在的情況下，高溫依舊能增強(qiáng)抗病毒RNA沉默，而且RNA沉默受高溫的誘導(dǎo)有積累效應(yīng)，需要高溫處理一定時(shí)間才能達(dá)到完全抵抗PVX病毒侵染的作用。將30℃高溫預(yù)處理

10、12天的心葉煙置于22℃孵育1-4天后接接種病毒,7天后上部葉片仍無(wú)明顯癥狀，而隨著孵育天數(shù)的延長(zhǎng)，接毒7天后的癥狀逐漸加重,22℃孵育12天的心葉煙在接毒7天后已觀察到明顯癥狀，ELISA檢測(cè)病毒含量接近22℃發(fā)病株水平。這說(shuō)明心葉煙中受高溫影響而積累的抗病毒RNA沉默隨著溫度降低后仍能持續(xù)一段時(shí)間。
　　 （6）本生煙對(duì)PVX病毒的抗性在高溫下也有所增強(qiáng)(30℃)，然而30℃高溫預(yù)處理12天后，接毒7天后植株仍出現(xiàn)明顯PVX

11、癥狀，這不同于心葉煙的試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明高溫雖然能夠增強(qiáng)本生煙的抗病毒RNA沉默，但這種增強(qiáng)不能持續(xù)，一旦高溫條件撤除，抗病毒RNA沉默隨之會(huì)降低到不足以抵抗病毒入侵的程度。這可能是由于本生煙與心葉煙相比缺乏RDR1（本生煙只有RDR6），而使其RNA沉默途徑有所不同。
　　 （7）心葉煙和本生煙瞬時(shí)侵染GFP試驗(yàn)表明,22℃ 瞬時(shí)侵染5dpi時(shí)侵染區(qū)發(fā)生GFP沉默，而30℃ 3dpi時(shí)侵染區(qū)已發(fā)生GFP沉默，這說(shuō)明高溫也促進(jìn)瞬時(shí)侵