水楊酸和高溫對(duì)RNA沉默影響的初步研究.pdf

1、RNA沉默是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一種序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因失活機(jī)制，有研究表明，高溫增強(qiáng)病毒及轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的RNA沉默，水楊酸也與RNA沉默介導(dǎo)的病毒抗性有關(guān)。但具體的影響機(jī)制還不清楚。
　　 本研究利用煙草材料，探討了瞬時(shí)侵染介導(dǎo)的RNA沉默、病毒介導(dǎo)的RNA沉默受溫度和水楊酸的影響及其相互關(guān)系，具體研究結(jié)果如下:
　　 (1)農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染試驗(yàn)表明，高溫及水楊酸均能促進(jìn)瞬時(shí)侵染介導(dǎo)的RNA沉默。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，野生型

2、三生煙侵染后第5天，侵染區(qū)GFP完全沉默，而24℃培養(yǎng)條件下，侵染后第5天，侵染區(qū)仍有GFP熒光。NahG轉(zhuǎn)基因植株30℃，侵染后5天仍有微弱GFP熒光，24℃檢測(cè)到的GFP熒光也強(qiáng)于野生型植株。NahG為水楊酸(SA)羥化酶基因，SA羥化酶催化SA成兒茶酚，使NahG轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)SA水平大大低于野生型植株，因此推測(cè)NahG轉(zhuǎn)基因植株RNA沉默程度降低很可能與SA減少有關(guān)，而體外噴施SA的實(shí)驗(yàn)也證明水楊酸的確能促進(jìn)瞬時(shí)侵染介導(dǎo)的RNA

3、沉默。為了研究高溫、水楊酸對(duì)RNA沉默的影響機(jī)制，我們通過熒光定量PCR檢測(cè)了5種SA誘導(dǎo)的抗病相關(guān)基因AOX1、RDR1、PRla、 PR2和PRlb表達(dá)水平，結(jié)果表明，在RNA沉默程度最高的30℃處理野生型三生煙中，這5種基因的表達(dá)量明顯高于24℃處理野生型和30℃處理NahG轉(zhuǎn)基因等低沉默程度的植株。這說明高溫對(duì)5種抗病基因的誘導(dǎo)是通過影響SA實(shí)現(xiàn)的，RNA沉默與水楊酸介導(dǎo)的SAR防御反應(yīng)均受高溫激發(fā)，兩種防御途徑可能存在交叉互作

4、，有研究表明，高溫處理會(huì)使植物葉片中自由態(tài)SA含量迅速升高，因此推測(cè)高溫可能通過提高SA水平進(jìn)而促進(jìn)RNA沉默。
　　 (2) PVX病毒接種試驗(yàn)表明，高溫及水楊酸均能促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的RNA沉默。PVX接種煙草葉片14天后觀察，24℃處理植株出現(xiàn)明顯癥狀，30℃處理植株不發(fā)病，而24℃、30℃處理NahG轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為整株系統(tǒng)感病，而且24℃處理下的NahG轉(zhuǎn)基因接種植株發(fā)病程度及病毒含量均高于野生型植株。這說明高溫能促進(jìn)抗病

5、毒RNA沉默，而通過轉(zhuǎn)NahG基因降低了植株內(nèi)SA水平時(shí)，高溫便不能有效激活抗病毒RNA沉默。綜上所述，SA可能在誘導(dǎo)RNA沉默中起關(guān)鍵作用，且位于高溫響應(yīng)的下游，一旦SA合成途徑受干擾或被阻斷，高溫促進(jìn)RNA沉默的作用便會(huì)受影響。為了進(jìn)一步探討溫度、水楊酸對(duì)病毒誘導(dǎo)的RNA沉默的影響機(jī)制，我們通過熒光定量PCR檢測(cè)了5種SA誘導(dǎo)的抗病相關(guān)基因AOX1、RDR1、PRla、PR2和PRlb，結(jié)果表明，AOX1、PRla、PR2和PRlb

6、在發(fā)病最嚴(yán)重的24℃處理下的NahG轉(zhuǎn)基因接種植株中表達(dá)量高于30℃處理下的NahG轉(zhuǎn)基因接種植株，野生型植株中4種基因的表達(dá)量24℃處理高于30℃處理，而RDR1的表達(dá)量各處理間沒有明顯差異。這表明AOX1、PRla、PR2和PRlb可能受PVX病毒直接誘導(dǎo)，而不受RNA沉默程度影響。
　　 (3)為了研究沉默增強(qiáng)過程中涉及的植物相關(guān)基因，對(duì)高溫及水楊酸處理的瞬時(shí)侵染本生煙材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果表明，高溫、水楊酸處理與

7、對(duì)照的差異表達(dá)基因數(shù)分別為601個(gè)和14個(gè)，其中共有差異表達(dá)基因?yàn)?個(gè)，高溫處理與對(duì)照相比，有上調(diào)基因363個(gè)，下調(diào)基因238個(gè);水楊酸處理與對(duì)照相比，上調(diào)基因7個(gè)，下調(diào)基因7個(gè)，涉及基因較少，上下調(diào)程度也較低。我們利用qRT-PCR的方法檢測(cè)了4個(gè)高溫處理上調(diào)基因comp42463_c0，comp40795_c0，comp44509_c0及comp46958_c0，其log2變化倍數(shù)分別為3.5851，2.1887，2.4862及2.

8、3758。4個(gè)水楊酸處理上調(diào)基因comp62975_c0，comp30068_c0，comp61011_c0及comp40205_c0，其log2變化倍數(shù)分別為2.8046，1.9292，1.1253及1.0992的表達(dá)量，結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是可靠的。其中comp46958_c0為脯氨酸豐富蛋白，在脅迫條件下，許多植物體內(nèi)脯氨酸大量積累，它在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒等方面起重要作用。comp62