病毒基因介導(dǎo)的抗性機(jī)制及抗病毒轉(zhuǎn)基因西瓜的研究.pdf

1、為了探討不同轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)形式對誘發(fā)植物基因沉默,以及在病原介導(dǎo)抗病性中的作用,構(gòu)建了五種不同結(jié)構(gòu)形式的煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白(CP)基因植物表達(dá)載體:pS18、pR29、pDS24、pⅡ38和pⅢ19,借助于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(pAL4404)將它們轉(zhuǎn)入煙草(Nicotianatabaccum cv.NC89).經(jīng)過Southern-blot檢測,證明五種載體均成功地

2、轉(zhuǎn)入了煙草植株,轉(zhuǎn)化率約在37-59﹪之間,插入拷貝數(shù)1到6個(gè)不等.T0代的RT-PCR顯示,除載體pDS24轉(zhuǎn)基因植株中的外源基因沒有按照預(yù)期的那樣轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA以外,其它基因結(jié)構(gòu)形式均得到了正常轉(zhuǎn)錄.5種基因結(jié)構(gòu)形式的T2代轉(zhuǎn)基因植株的抗病試驗(yàn)證明,到開花期為止仍有部分植株不表現(xiàn)病狀,而且載體pⅡ38、pⅢ19轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)病率低于其它結(jié)構(gòu)形式的轉(zhuǎn)基因植株.這說明,外源基因的直接重復(fù)序列所介導(dǎo)的抗病性水平較其它結(jié)構(gòu)形式更高.對T

3、2、T3代轉(zhuǎn)基因植株的甲基化分析顯示,與重復(fù)序列相比,外源基因的插入拷貝數(shù)與其甲基化關(guān)系更密切,甲基化程度也和植株的抗性有一定的正相關(guān).至于外源基因直接重復(fù)對轉(zhuǎn)錄后基因沉默水平的影響,Northern-blot結(jié)果顯示,相對于含有2個(gè)基因直接重復(fù)序列的轉(zhuǎn)基因植株,由3個(gè)相同基因構(gòu)成的直接重復(fù)序列的外源基因更容易形成轉(zhuǎn)錄后基因沉默.針對目前中國西瓜生產(chǎn)種植中的病毒病危害,為了培育抗多種病毒的轉(zhuǎn)基因西瓜,我們構(gòu)建了同時(shí)含有西瓜花葉病毒(WM

4、V)外殼蛋白(CP)基因、西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)復(fù)制酶(NIb)基因和黃瓜花葉病毒(CMV)復(fù)制酶基因的三價(jià)植物表達(dá)載體pBWCZ-44,經(jīng)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(pAL4404)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化西瓜子葉外植體,獲得再生植株.經(jīng)PCR和Southern-blot檢測,證明目的基因成功地導(dǎo)入西瓜植株,并能夠在后代植株中遺傳,最終轉(zhuǎn)化效率約為1.7‰.分別在溫室和大田中對T2、T3代