兩種抗病毒策略介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因研究和煙草脈帶花葉病毒蛋白的表達(dá).pdf

1、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)是煙草上的三大主要病毒病。病毒間的復(fù)合侵染非常普遍，往往給煙草生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。本研究利用適體和小干擾。RNA2種不同的策略獲得了同時(shí)抗2種或3種病毒的轉(zhuǎn)基因煙草。煙草脈帶花葉病毒(Tobacco veinbanding mosaic virus，TVBMV)屬于馬

2、鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒，近幾年在我國(guó)煙草上的發(fā)生有上升和蔓延的趨勢(shì)。本研究獲得了TVBMV YND分離物的全基因組序列，利用原核表達(dá)方法成功表達(dá)了TNBMV10個(gè)蛋白中除了P3蛋白之外的9個(gè)，并利用鎳柱對(duì)部分蛋白進(jìn)行了純化，同時(shí)制備了TVBMV CP的抗血清。主要結(jié)果如下： 將編碼一個(gè)九肽(與CMV CP互作)和PVYHC-Pro N端83個(gè)氨基酸(與HC-Pro蛋白自身互作)的基因片段(C-P)與GFP基因(G

3、FP)同時(shí)連接到pMD18-T載體，通過(guò)定點(diǎn)突變獲得了3個(gè)突變體。將C-P-GFP及其3個(gè)突變體分別連接到植物表達(dá)載體pROK Ⅱ上，農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)后接種實(shí)驗(yàn)篩選到最有效的抗性誘導(dǎo)載體。將此載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化煙草K326，分子檢測(cè)獲得了15棵轉(zhuǎn)基因煙草?？共⌒詫?shí)驗(yàn)表明獲得抗PVY的轉(zhuǎn)基因煙草1棵，抗CMV的植株3棵，同時(shí)抗PVY和CMV的植株1棵。首次利用適體策略獲得了同時(shí)抗PVY和CMV的轉(zhuǎn)基因煙草。 利用軟件篩選到能

4、夠有效切割PVX和CMV CP基因的siRNA以及PVY HC-Pro基因中能夠有效形成siRNA的區(qū)域，將篩選片段連接構(gòu)建反向重復(fù)的植物表達(dá)載體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草K326，分子檢測(cè)證明成功獲得了22棵轉(zhuǎn)基因煙草。抗病性分析表明獲得了2棵抗PVY、8棵抗CMV和6棵抗PVX的轉(zhuǎn)基因煙草，同時(shí)抗3種病毒的轉(zhuǎn)基因煙草1棵。ELISA和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明抗病的轉(zhuǎn)基因植株中病毒含量均明顯低于感病對(duì)照，說(shuō)明篩選的siRNA能夠特

5、異性地降解病毒的mRNA，有效抑制病毒的復(fù)制。 利用針對(duì)馬鈴薯Y病毒屬病毒的簡(jiǎn)并或特異引物，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增得到TVBMV云南分離物YND的全基因組序列。除了3'-端poly(A)外，YND基因組全序列包括9570個(gè)核苷酸，含有一個(gè)大的開放閱讀框，編碼一個(gè)由3079個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，分子量約為348.6 kDa。該分離物的NIb/CP切割位點(diǎn)為Q/N，這在馬鈴薯Y病毒屬病毒中非常少見(jiàn)。另外，HC-Pro中含有比較罕

6、見(jiàn)的參與蚜傳的RITC基序。 將TVBMV CP基因克隆到表達(dá)載體pET-22b(+)上，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)出分子量為35.0 kDa的融合蛋白。利用該融合蛋白制備了YVBMV的多克隆抗體，ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)為1/4096。Western blotting和DIBA分析結(jié)果表明，獲得的抗血清和原核表達(dá)的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特異性反應(yīng)，可用于TVBMV的快速檢測(cè)。同時(shí)在大腸桿菌中成功表達(dá)了TV