基于狗尾草花葉病毒構建病毒介導的基因沉默載體.pdf

1、病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是最近幾年來較為盛行的一種運用植物病毒載體來抑制植物宿主內(nèi)源基因表達的有效手段。病毒通過改造后攜帶了一段和植物同源的基因，進而通過侵染誘導植物沉默內(nèi)源基因。宿主VI GS作為一項有效的研究植物基因功能的實驗方法，具有操作簡單、周期短、效率高、成本低廉等特點。狗尾草花葉病毒（Foxtail mosaic virus,FoMV）是馬鈴薯X病毒屬（Pote

2、xvirus）的成員，單鏈正義RNA，有著非常廣泛的宿主范圍，可侵染包括水稻、大麥、高粱等56種禾本科植物和35種雙子葉植物。國內(nèi)外對于利用FoMV改造成病毒VIGS載體還沒有相關的報道。
　　本研究以pCB301-FoMV載體為母體，設計了2種病毒載體構建策略：1、通過破壞5A的ORF框，使其不表達，同時在其中插入多克隆位點，構建載體pCB301-FoMV-Vector-MCS，2、在野生型FoMV的CP終止密碼子之后插入多克隆

3、位點，構建載體pCB301-FoMV-CP-MCS。在以上兩個病毒載體的基礎上，以重復外殼蛋白亞基因組啟動子的方式，利用該病毒載體表達綠色熒光蛋白（GFP）。本實驗選取了與FoMV同屬的馬鈴薯X病毒（PVX）的CP亞基因組啟動子，完成對pC B301-FoMV-Vector-PVX-GFP和pCB301-FoMV-CP-PVX-GFP的構建，結果表明，pCB301-FoMV-Vector-PVX-GFP浸潤接種的本氏煙在接種葉和系統(tǒng)葉都

4、無綠色熒光，并且在系統(tǒng)葉葉也檢測不到病毒，pCB301-FoMV-Vector-PVX-GFP沒有侵染活性，其原因可能是，雖5A蛋白對于病毒的復制不重要，但5A蛋白的堿基序列對于指引CP的正確表達起作用。載體pCB301-FoMV-CP-PVX-GFP，在接種葉能發(fā)出綠色熒光，但是熒光僅限制在接種區(qū)域，系統(tǒng)葉并沒有出現(xiàn)綠色熒光，經(jīng)RT-PCR分析，在系統(tǒng)葉卻能檢測到病毒，但所擴增出的條帶和預期大小不符，出現(xiàn)了和野生型病毒相同的條帶。

5、r>　　在載體pCB301-FoMV-CP-MCS的基礎上，我們反向插入了本氏煙的Su片段和大麥的PDS片段，獲得pCB301-FoMV-CP-NbSu和pCB301-FoMV-CP-HvPDS克隆。pCB301-FoMV-CP-NbSu接種結果表明，在本氏煙中成功誘導了本氏煙對自身Su基因的沉默，出現(xiàn)了黃斑現(xiàn)象。在單子葉植物大麥（Hordeum v ulgare）中，我們先將攜帶有大麥PDS片段的病毒載體pCB301-FoMV-CP-