dsRNA介導(dǎo)的煙草抗煙草花葉病毒（TMV）的研究.pdf

1、該研究以在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出RNA沉默的高效誘導(dǎo)因子—雙鏈RNA(dsRNA)為目標,將煙草花葉病毒(TMV)部分移動蛋白基因(△MP)以反向重復(fù)的方式與大豆內(nèi)含子相連,并定向插入到植物表達載體pBIN438上35S啟動子下游;以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,獲得50株轉(zhuǎn)基因煙草,并對這轉(zhuǎn)基因煙草進行了抗病性研究及抗性機制初探.根據(jù)已報道TMV△MP的核苷酸序列設(shè)計特異性引物,分別從質(zhì)粒pTMP(+)擴增正反向△MP基因,并與pGEM-TVecto

2、r相連.反向△MP基因用PstI和BamHI切下,將所得基因片段與用同樣酶切開的含內(nèi)含子的pSK-In相連,獲得重組質(zhì)粒命名為pSK-In-△MP.再用SalI和BamHI將包括Intron和反向△MP基因在內(nèi)的片段切下,定向插入至同樣酶切開的pBIN438上,獲得重組質(zhì)粒pBIN-In-△MP.正向△MP基因片段用SalI切下,插入被SalI切開且已去磷酸化的pBIN-In-△MP上,鑒定篩選得到含有△MP基因的反向重復(fù)植物表達載體p

3、BIN-TMV△MP(i/r).用三親交配法將植物表達載體pBIN-TMV△MP(i/r)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHAl05菌株中,經(jīng)鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子用于煙草轉(zhuǎn)化.煙草轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將含TMV△ MP(i/r)基因的農(nóng)桿菌與煙草葉盤共培養(yǎng),經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因再生植株50株,所有植株的PCR檢測均為陽性.對部分植株進行Southern印跡雜交,結(jié)果表明TMV△MP(i/r)已整合到煙草基因組中.用TMV病汁液接種50株轉(zhuǎn)基因煙草

4、,癥狀觀察和ELISA檢測表明,轉(zhuǎn)基因煙草植株對TMV表現(xiàn)出不同的抗病性反應(yīng),可將其劃分為三種抗病性類型:免疫型,植株在整個生育期無癥狀,并檢測不到病毒;抗病型,植株前期無癥狀,后期有輕微癥狀,并能檢測到少量病毒;感病型,植株在整個生育期發(fā)病較重,且能檢測到大量病.50株植株中免疫型共5株,占10％,抗病型共2株,占4％,感病型共43株,占86％.轉(zhuǎn)基因植株Northem印跡雜交表明,不同抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植株△MP基因mRNA在細胞質(zhì)中