康寧霉素抗煙草花葉病毒活性及其調(diào)控?cái)M南芥根系生長(zhǎng)的機(jī)制.pdf

1、木霉(Trichoderma spp.)是一類廣泛分布于土壤、根圍和葉際的腐生真菌，屬于半知菌亞門，叢梗孢目，木霉屬。人們很早以前就意識(shí)到木霉對(duì)多種植物病原菌具有良好的生物防治功能，是一種重要的生防因子。病毒病是一類重要的植物病害，能夠嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法極易使病毒產(chǎn)生抗藥性，防治效果并不理想。微生物源抗植物病毒活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，為解決這一問題提供了新的途徑。研究表明，哈茨木霉和綠色木霉在

2、黃瓜根部定植以后可以顯著改善植株對(duì)黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染的抵抗能力。近幾年，國(guó)內(nèi)外對(duì)木霉生防作用和生防機(jī)制的研究主要集中在病原真菌和病原細(xì)菌上，有關(guān)木霉對(duì)植物病毒病的防治效果和相應(yīng)生防機(jī)制的研究很少。Peptaibols是一類主要由木霉合成的特殊的抗菌肽，具有多種生物學(xué)活性，是重要的木霉次生代謝產(chǎn)物。
　　 本實(shí)驗(yàn)室從擬康氏木霉生防菌SMF2(T.pseudokoningii SMF2)的固體培養(yǎng)物中分離提純了一類peptaib

3、ols抗菌肽，命名為康寧霉素(trichokonins，TKs)，前期研究工作表明TKs對(duì)植物病原真菌和病原細(xì)菌具有廣譜的抗菌活性。例如，放線菌Apiocrea spp.產(chǎn)生的兩種peptaibols抗菌肽peptavirins A和peptavirins B對(duì)煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)有抑制作用。為了解產(chǎn)自擬康氏木霉的peptaibols抗菌肽--康寧霉素是否具有抗植物病毒活性，本論文以抗性煙草品

4、種枯斑三生(Nicotiana tabacum L.cv.Samsun)為植物材料，通過體外鈍化和誘導(dǎo)抗性兩個(gè)方面研究了TKs對(duì)TMV的防治效果，并且進(jìn)一步對(duì)TKs抗TMV的機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 除了生防作用之外，人們還發(fā)現(xiàn)許多木霉菌株同時(shí)具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。到目前為止，已經(jīng)有大量研究表明多種生防木霉可以直接促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，提高農(nóng)作物產(chǎn)量。但是關(guān)于木霉產(chǎn)peptaibols抗菌肽對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其可能的作用機(jī)制卻鮮有

5、報(bào)道。本論文以TKs中主要的生物學(xué)活性成分康寧霉素Ⅵ(trichokoninsⅥ，TKⅥ)為代表，研究了擬康氏木霉生防菌SMF2產(chǎn)的peptaibols抗菌肽對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，著重研究了TKⅥ對(duì)擬南芥根系形態(tài)建成的影響，并從激素生理調(diào)控機(jī)制的角度對(duì)其促生長(zhǎng)機(jī)制進(jìn)行了深入研究。
　　 本論文從生防和促生長(zhǎng)兩個(gè)角度對(duì)擬康氏木霉菌株SMF2產(chǎn)的peptaibols抗菌肽的生物學(xué)活性進(jìn)行了研究，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　

6、 一、康寧霉素抗煙草花葉病毒活性及其作用機(jī)制研究1.康寧霉素對(duì)TMV的體外鈍化作用將不同濃度TKs與TMV病毒精提液混合處理，用半葉法接種煙草葉片，培養(yǎng)6 d后統(tǒng)計(jì)平均枯斑抑制率。結(jié)果顯示，當(dāng)處理濃度為20 gM時(shí)，TKs可以對(duì)TMV產(chǎn)生明顯的體外鈍化作用，煙草的平均枯斑抑制率為58％。在100 nM的處理濃度下TKs對(duì)TMV雖然也表現(xiàn)出一定的鈍化作用，可以導(dǎo)致電鏡視野中部分TMV粒體形態(tài)的變化，但是這一濃度TKs處理后TMV對(duì)煙草的侵

7、染力基本沒有受到影響，煙草的平均枯斑抑制率僅為23％。因此我們推斷TKs對(duì)TMV的體外鈍化作用存在濃度依賴性，并且鈍化并非TKs低濃度(100 nM)下抗TMV活性的主要作用機(jī)制。
　　 2.康寧霉素誘導(dǎo)煙草抗TMV活性及其作用機(jī)制研究用50 nM、100 nM和200 nM TKs噴施處理煙草幼苗下位葉片。誘導(dǎo)4 d后在上位葉片接種 TMV，統(tǒng)計(jì)煙草平均枯斑抑制率分別為15％、54％和35％。其中，TKs誘導(dǎo)濃度為100 nM

8、時(shí)，對(duì)TMV具有最佳的誘導(dǎo)抗性作用。并且100 nMTKs誘導(dǎo)處理后接種 TMV，煙草葉片平均枯斑直徑和枯斑面積僅為對(duì)照組的57％和30％。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TKs在低濃度(100 nM)下對(duì)煙草花葉病的防治機(jī)制主要為誘導(dǎo)植物抗性。
　　 進(jìn)一步從生理和分子生物學(xué)的角度對(duì)TKs誘導(dǎo)植物抗性的機(jī)制進(jìn)行了探討。用100 nM TKs處理煙草可以誘導(dǎo)植物早期防御反應(yīng)因子--活性氧和酚類物質(zhì)的大量積累。同時(shí)，TKs處理還可以引起煙草防御酶

9、系統(tǒng)中PAL、POD和PPO酶活性的增加。對(duì)部分抗病基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶基因以及與水楊酸、乙烯和茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的部分基因表達(dá)量均發(fā)生了不同幅度的上調(diào)。其中與水楊酸信號(hào)途徑有關(guān)的酸性PR蛋白基因NtPR1α在噴施。TKs后1 h內(nèi)表達(dá)量提升了4.5倍。以上結(jié)果說明，TKs對(duì)植物的誘導(dǎo)抗性可以通過激活植物體內(nèi)以水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為主的復(fù)雜的防御反應(yīng)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。
　　 二、康寧霉素Ⅵ對(duì)植物

10、生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其機(jī)制研究1.康寧霉素Ⅵ對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響選擇雙子葉植物擬南芥、煙草和苜蓿以及單子葉植物玉米、水稻和小麥為代表，初步研究了不同濃度TKⅥ對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。將不同濃度的TKⅥ添加到基本培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基)中。將擬南芥種子春化處理后進(jìn)行豎直培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中觀察記錄幼苗的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明，雖然擬南芥不同生態(tài)型(Col、Ws和Ler)對(duì)TKⅥ的敏感程度存在較大差異，但總體來看，在低濃度TKⅥ(5-500 nM)

11、處理時(shí)都可以觀察到不同程度的促生長(zhǎng)現(xiàn)象。低濃度TKⅥ(5-50 nM)對(duì)煙草和苜蓿幼苗的生長(zhǎng)同樣存在不同程度的促進(jìn)作用，高濃度(5μM)下表現(xiàn)為顯著的生長(zhǎng)抑制作用。與以上結(jié)果不同的是，TKⅥ處理濃度在5nM以上時(shí)對(duì)單子葉植物玉米、水稻和小麥幼苗的生長(zhǎng)存在普遍的抑制作用。因此推斷TKⅥ在低濃度(5-50 nM)下對(duì)雙子葉植物存在明顯的促生長(zhǎng)作用，高濃度(5μM)下則嚴(yán)重抑制生長(zhǎng)。但是與雙子葉植物相比較，相同的處理濃度下TKⅥ對(duì)單子葉植物則

12、具有更高的植物毒性。選擇對(duì)TKⅥ敏感的擬南芥Col生態(tài)型進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了TKⅥ對(duì)幼苗根系生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，50 nM TKⅥ對(duì)幼苗根系的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最明顯，TKⅥ處理后幼苗地上部分和地下部分的生物量分別為對(duì)照的1.7倍和2.3倍；而在5μM濃度下TKⅥ則表現(xiàn)出對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，在這一處理濃度下幼苗的生長(zhǎng)幾乎停滯，生物量?jī)H為對(duì)照的50％左右。對(duì)主根長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)表明：對(duì)于不同生長(zhǎng)階段的幼苗，TKⅥ對(duì)主根的促生長(zhǎng)速率是一致的。對(duì)側(cè)根的數(shù)目、

13、側(cè)根密度和不同側(cè)根發(fā)育階段所包含的側(cè)根原基數(shù)量的統(tǒng)計(jì)顯示：雖然50 nM TKⅥ處理可以使可見側(cè)根數(shù)量明顯增加，但是對(duì)側(cè)根密度和側(cè)根原基總數(shù)并沒產(chǎn)生顯著的影響。這一結(jié)果表明TKⅥ的促生長(zhǎng)作用可能和誘導(dǎo)植物內(nèi)源生長(zhǎng)素合成無(wú)關(guān)。
　　 2.康寧霉素Ⅵ促進(jìn)擬南芥根系生長(zhǎng)的機(jī)制研究植物根系的生長(zhǎng)包括頂端分生組織細(xì)胞的不斷分裂和伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的同步伸長(zhǎng)兩個(gè)部分。用體式鏡和微分干涉顯微鏡觀察，并用CycB1∷GUS標(biāo)記基因標(biāo)記主根處在分裂期的細(xì)

14、胞區(qū)域。結(jié)果表明，50 nM的TKⅥ處理可以使幼苗根尖分生區(qū)范圍擴(kuò)大，分裂活動(dòng)旺盛，細(xì)胞數(shù)目增多。利用組織透明的方法處理根尖，觀察并統(tǒng)計(jì)擬南芥根尖同一位置成熟區(qū)細(xì)胞長(zhǎng)度。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比50 nM的TKⅥ處理后細(xì)胞長(zhǎng)度增加了2倍。利用生長(zhǎng)素響應(yīng)的DR5∷GFP轉(zhuǎn)基因株系和生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑NPA，進(jìn)一步研究了不同濃度的TKⅥ對(duì)主根根尖中生長(zhǎng)素分布情況的影響。結(jié)果證實(shí)，TKⅥ處理的確影響了根尖處生長(zhǎng)素的分布。利用生長(zhǎng)素輸入載體AUX

15、1和生長(zhǎng)素輸出載體PIN2的功能缺失突變體aux1-7和eir1-1研究了TKⅥ調(diào)控的生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制。通過對(duì)主根長(zhǎng)度和可見側(cè)根數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)TKⅥ引起的促生長(zhǎng)作用主要與生長(zhǎng)素輸出載體的功能有關(guān)，而與生長(zhǎng)素輸入載體無(wú)關(guān)。進(jìn)一步利用PINs∷GFP轉(zhuǎn)基因株系研究了TKⅥ對(duì)生長(zhǎng)素輸出載體分布和表達(dá)情況的影響。結(jié)果表明TKⅥ可以通過調(diào)控根部生長(zhǎng)素輸出載體PINs家族蛋白的活性，促進(jìn)根部生長(zhǎng)素的向項(xiàng)運(yùn)輸，抑制生長(zhǎng)素的向基運(yùn)輸。