馬鈴薯Y病毒復(fù)制酶基因介導(dǎo)的病毒抗性研究.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬是植物病毒中最大的一個(gè)屬，包括馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）等，對(duì)世界范圍內(nèi)的經(jīng)濟(jì)作物造成的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。PVY存在著明顯的株系分化現(xiàn)象，在寄主與病原相互作用中，且隨著抗病品種等的應(yīng)用，新的株系將會(huì)不斷出現(xiàn)。RNA介導(dǎo)的病毒抗性（RNA-mediated virus r

2、esistance，RMVR）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的抗病毒基因工程策略，具有抗病程度高（近乎免疫）、抗性持久、生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)。RNA介導(dǎo)的抗性也存在著一定的局限性，即抗性譜較窄，但這種局限性可以用同時(shí)表達(dá)多個(gè)不同的病毒RNA序列所彌補(bǔ)，所以可以把不同病毒的有效核酸片段連接起來(lái)轉(zhuǎn)化植物，獲得多抗植株。在前期的研究中，我們對(duì)CP基因在RNA水平上介導(dǎo)的病毒抗性進(jìn)行了深入系統(tǒng)地研究，并且發(fā)現(xiàn)CP基因的3’端和5’端序列介導(dǎo)的病毒抗性存

3、在顯著差異?；谏a(chǎn)中存在的問(wèn)題和本實(shí)驗(yàn)室的研究基礎(chǔ)，本研究的第一個(gè)內(nèi)容用馬鈴薯Y病毒的復(fù)制酶基因（nuclear inclusion b，NIb）的保守序列作為轉(zhuǎn)基因材料，探討核苷酸序列同源性與RNA介導(dǎo)的病毒抗性產(chǎn)生的關(guān)系，以及利用同源片段培育多抗病毒（株系）的可能性，研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明RNA介導(dǎo)基因沉默（病毒抗性）產(chǎn)生的機(jī)制，及利用該策略培育多抗病毒（株系）轉(zhuǎn)基因植物提供依據(jù)。第二個(gè)內(nèi)容是用馬鈴薯Y病毒NIb基因不同位置51bp

4、長(zhǎng)度片段構(gòu)建反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，探討NIb基因不同位置的cDNA區(qū)段對(duì)RNA介導(dǎo)病毒抗性的影響，本研究結(jié)果對(duì)于有效地選擇靶位點(diǎn)序列和成功應(yīng)用RNA介導(dǎo)的病毒抗性策略，具有重大指導(dǎo)意義，研究結(jié)果和主要結(jié)論如下：
　　 根據(jù)已克隆的PVY-SD1 N Ib的全長(zhǎng)cDNA序列（1557bp）序列設(shè)計(jì)了5段保守序列基因片段的特異引物，以PVY-SD1NIb的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，雙酶切純化后，與用相同酶

5、處理的pROKⅡ連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選并獲得重組表達(dá)質(zhì)粒PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ。酶切鑒定表明成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體。將成功構(gòu)建的植物表達(dá)載體利用凍融法直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89。再生植株經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ分別獲得168、150、166、155和170株T0

6、代轉(zhuǎn)基因植株。5種轉(zhuǎn)基因煙草分別接種PVY3個(gè)分離物和TEV-SD1分離物后，發(fā)現(xiàn)：5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ接種分離物PVY-SD1，轉(zhuǎn)基因植株中抗性植株的比例分別為26.4％、22.6％、36％、20.2％和21.7％；接種分離物PVY-SD5，除了轉(zhuǎn)基因株系PRIR-Ⅳ（84.3％）未獲得抗性植株外，其余4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（PR IR-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ）中抗性植株的比例分別為2.5

7、％、3.0％、15.6％和4.3％；接種PVY-SD4和TEV-SD1則全部感病。結(jié)果顯示：當(dāng)轉(zhuǎn)基因與病毒RNA序列間的同源性為100％-90.2％時(shí)，均可介導(dǎo)對(duì)病毒的抗性；同源性等于或低于88.2％時(shí)，則不能介導(dǎo)病毒抗性的產(chǎn)生。表明轉(zhuǎn)基因與病毒RNA序列間高度的同源是抗性產(chǎn)生所必需的，最低同源性在90％左右。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗性與同源性并不呈完全正相關(guān)。表明區(qū)段的位置或序列對(duì)RNA介導(dǎo)的病毒抗性產(chǎn)生也有影響。為了分析轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)與抗病性的

8、關(guān)系，對(duì)獲得的抗病轉(zhuǎn)基因植株和部分感病轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果表明，外源基因己整合到煙草基因組中，且轉(zhuǎn)基因植株的抗病性與轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)之間無(wú)明顯的相關(guān)性。轉(zhuǎn)基因植株的Northern雜交分析表明，轉(zhuǎn)基因都在RNA水平上得到了表達(dá)，抗病植株中RNA的積累量明顯低于同類型的感病植株，抗性與RNA積累量呈負(fù)相關(guān)；抗病轉(zhuǎn)基因植株中有siRNA存在，表明病毒抗性是由RNA介導(dǎo)的。
　　 根據(jù)已克隆的PVY-SD5 NI

9、b的全長(zhǎng)cDNA序列（1557bp）設(shè)計(jì)了5個(gè)不同位置，5'端（nt1-51）、5'端1/2（nt364-414）、中間（nt753-803）、3'端1/2（nt1143-1193）和3'端（nt1507-1557）基因片段的特異引物，以PVY-SD5 NIb的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到51bp的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切后，用T4DNA連接酶于16℃體外連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。篩選并獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pRIR-N

10、IbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ。酶切鑒定表明成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體。將成功構(gòu)建的植物表達(dá)載體利用凍融法直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89。轉(zhuǎn)化pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)卡那霉素篩選和PCR檢測(cè)，分別獲得61、58、64、67和56株T0代轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析表明：P

11、VY NIb基因不同位置cDNA區(qū)段介導(dǎo)的對(duì)PVY的抗性存在顯著差異，轉(zhuǎn)pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ株系中，抗病植株的比例分別為31.15％、10.34％、51.56％、67.16％和16.07％。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的Northern雜交分析表明，轉(zhuǎn)基因都在RNA水平上得到了表達(dá)，抗病植株中RNA的積累量明顯低于同類型的感病植株，抗性與RNA積累量呈負(fù)相關(guān)；抗病轉(zhuǎn)基因植