黃曲條跳甲關(guān)鍵功能基因的克隆及利用RNAi技術(shù)控制害蟲(chóng).pdf

1、黃曲條跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)(鞘翅目Coleoptera：葉甲科Chrysomelidae)是廣泛分布于世界各地的重要害蟲(chóng)。本論文從黃曲條跳甲能量代謝系統(tǒng)和嗅覺(jué)識(shí)別系統(tǒng)兩個(gè)生命活動(dòng)的主要方面出發(fā)，采用RACE技術(shù)分別克隆了跳甲的精氨酸激酶基因和一個(gè)特殊的氣味受體基因，應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)基因及表達(dá)蛋白序列進(jìn)行了分析；并基于目的基因的功能區(qū)域，設(shè)計(jì)和構(gòu)建了雙鏈RNA)(dsRNA)片段；采用R

2、NA干擾技術(shù)，從生物體自身功能角度出發(fā)，破壞其正常能量代謝途徑或使之喪失氣味識(shí)別能力，從而達(dá)到有效防治害蟲(chóng)的目的。本文也證明基于精氨酸激酶及該氣味受體的RNA干擾技術(shù)是一項(xiàng)潛在和有吸引力的新技術(shù)，將有助于發(fā)展新的害蟲(chóng)控制試劑。主要內(nèi)容如下： 1.利用RACE技術(shù)克隆獲得黃曲條跳甲精氨酸激酶基因(Phyllotreta striolataArginine kinase，PsAK)，cDNA全長(zhǎng)為1508 bp，PsAK的全長(zhǎng)cDN

3、A已在GenBank登錄，登錄號(hào)為EU420057。PsAK的5'、3'端非編碼區(qū)分別為51 bp和386 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為1071 bp，ORF編碼356個(gè)氨基酸，其蛋白分子量為40.02KDa，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為5.86。利用蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)分析軟件對(duì)PsAK氨基酸序列進(jìn)行分析。 結(jié)果顯示：位于PsAK氨基酸序列中的7個(gè)氨基酸CPTNLGT(271-277)是精氨酸激酶的活性中心部位序列，其中第271位的半胱氨酸(Cy

4、s)是精氨酸激酶所必需的酶活性位點(diǎn)。PsAK與已報(bào)道的其他昆蟲(chóng)的精氨酸激酶氨基酸序列比對(duì)，相似性達(dá)66％-91％。PsAK模擬的3-D結(jié)構(gòu)非常類似Limulus polyhemusAK(epAK)的過(guò)渡狀態(tài)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，其序列一致性達(dá)到75％，在重疊的356個(gè)殘基中，RMSD的偏差僅為0.7 A。高度保守的殘基Asp62的OD2原子與Arg193的NH2的空間距離僅2.86 A，可以形成強(qiáng)烈的靜電相互作用，起到了穩(wěn)定分子空間構(gòu)象作用

5、。通過(guò)與LpAK空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行SuperPose疊合可預(yù)測(cè)出，在活性部位上有五個(gè)帶正電荷簇(Arg124，Arg126，Arg229，Arg280，Arg309)催化時(shí)與底物ADP結(jié)合；有七個(gè)保守的氨基酸(Gly64、Va165、Tyr68、Cys271、Ser63、Glu225、Glu314)與底物精氨酸協(xié)同結(jié)合。采用鄰接法(neighbourjoining，NJ)聚類分析結(jié)果表明，PsAK與其近緣種赤擬谷盜Tribolium cast

6、aneum的親緣關(guān)系最近，都屬于分類中經(jīng)典的第一組類型。 2.選擇PsAK的332 bp核苷酸片段(堿基790到1122，包含精氨酸激酶活性位點(diǎn)motif CPTNLGT)構(gòu)建dsRNA，然后配置含有不同濃度dsRNA的測(cè)試液噴灑于跳甲取食幼苗的子葉或葉片上。dsRNA喂飼分析表明，利用微量的dsRNA干擾害蟲(chóng)的精氨酸激酶能夠有效地?fù)p害其生存和繁殖。RT-PCR分析表明，與對(duì)照組相比，攝食dsRNA的測(cè)試組成蟲(chóng)中腸AK基因轉(zhuǎn)錄活

7、性降低，AK基因mRNA積累顯著減少。與未處理的對(duì)照組相比，AK的酶活檢測(cè)顯示出明顯的酶活性降低(P<0.05)，RT-PCR與酶活性檢測(cè)提供了鏈接AK基因沉默和甲蟲(chóng)滯育死亡的分子證據(jù)。本研究首次選用精氨酸激酶這個(gè)特殊基因，從生物體自身功能角度出發(fā)破壞其能量代謝途徑，從而導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡及生育力顯著下降。這些都表明基于精氨酸激酶的RNA干擾技術(shù)將有助于發(fā)展新的害蟲(chóng)控制試劑，在害蟲(chóng)防治中發(fā)揮作用。 3.從黃曲條跳甲觸角中克隆得到特殊的

8、氣味受體基因——果蠅氣味受體Or83b同源基因，命名為PsOrl，其基因編碼區(qū)為1437 bp，編碼478個(gè)氨基酸殘基.其蛋白理論分子量為54.06 KDa，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為7.98。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)PsOrl具有典型的G-蛋白偶聯(lián)受體特征，有七個(gè)轉(zhuǎn)膜螺旋，第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ螺旋軸和第Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ螺旋軸反向平行，除轉(zhuǎn)膜螺旋Ⅳ的長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸外，其它六個(gè)轉(zhuǎn)膜螺旋的長(zhǎng)度均為23個(gè)氨基酸.但是其Nin-Cout的膜拓?fù)鋵W(xué)與經(jīng)典的GPCR蛋

9、白相反。PsOrl與已經(jīng)報(bào)道的昆蟲(chóng)同類嗅覺(jué)受體有較高的同源性，組成蛋白羧基端的164個(gè)氨基酸(包括3個(gè)轉(zhuǎn)膜螺旋Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ)與其他昆蟲(chóng)同類嗅覺(jué)受體的同源性為82％-95％；特別是與近緣種赤擬谷盜Tribolium。castaneum 同源性高達(dá)95％，相似性達(dá)97％。這表明該區(qū)域極端保守的殘基是由于進(jìn)化中的負(fù)選擇壓力而保留下來(lái)，對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要。半定量RT-PCR研究表明，PsOrl主要在跳甲成蟲(chóng)觸角中表達(dá)，在頭部(包含口器)也

10、有表達(dá)，但表達(dá)量相對(duì)較低，在成蟲(chóng)其他的部位不表達(dá)，表明PsOrl可能也參與化學(xué)刺激的識(shí)別過(guò)程。 4.PsDrl基因具有高度的同源性，預(yù)示這個(gè)基因在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)中的重要作用。為了驗(yàn)證PsOrl基因與Drosophila melanogaster Or83b(Dmor83b)同源基因具有相類似功能，用RNA干擾技術(shù)沉默PsDrl來(lái)檢測(cè)跳甲對(duì)不同氣味的反應(yīng)能力。PsOrl cDNA轉(zhuǎn)膜螺旋第Ⅴ到Ⅶ之間的核苷酸片段被用于構(gòu)建dsRNA。化學(xué)

11、趨向行為反應(yīng)表明，基于與虛擬假設(shè)(Null hypothesis，即偏向氣殊源方向和偏離氣味源方向停留時(shí)間相等)比較的基礎(chǔ)上，野生型對(duì)引誘劑anyl isothioeyanate的氣味反應(yīng)敏感(t14=2.99，p=0.010)：對(duì)拒避劑a-pinene表現(xiàn)出明顯的拒避行為(f13=3.04，p=0.009)。PsDrl嗅覺(jué)受體被沉默的跳甲與野生型相比，對(duì)引誘劑allyl isothioeyaaate(t19=0.925，p=0.367

12、)和拒避劑a-pinene(t19=0.535，p=0.599)卻沒(méi)有明顯定向行為反應(yīng)，表現(xiàn)為隨機(jī)分布行為。RT-PCR分析從分子水平證明了RNAi處理后的跳甲觸角嗅覺(jué)受體表達(dá)受到了明顯抑制。 本研究進(jìn)一步從產(chǎn)卵選擇性和取食選擇性兩方面研究dsRNA沉默PsOrl后，跳甲對(duì)芥菜、蘿卜、大白菜、山西白和芥藍(lán)等5種十字花科蔬菜的寄主選擇性。結(jié)果表明，在野生型對(duì)照組中，跳甲的產(chǎn)卵選擇性與取食選擇性基本一致，芥菜為其最嗜寄主，芥藍(lán)為最不