脫氧雪腐鐮刀菌烯醇噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及原核表達.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是由多種鐮刀屬真菌代謝產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物。隨著小麥赤霉病的發(fā)生，DON的污染廣泛分布于世界各地，是食品和飼糧中污染率最高的霉菌毒素之一。蓄積在糧食中的DON被人畜攝食后，多表現(xiàn)出急性的嘔吐和拒食反應(yīng)，并且對機體產(chǎn)生生長抑制、免疫抑制、胚胎和細胞毒性，對畜禽和人的健康危害極大。
　　因此，對農(nóng)產(chǎn)品和食品中DON的檢測具有重要意義。本實驗通過噬菌體抗體庫技術(shù)篩選到抗DON

2、的單鏈抗體，并進行初步的原核表達，為噬菌體單鏈抗體在DON檢測中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　試驗Ⅰ脫氧雪腐鐮刀菌烯醇人工抗原的合成通過琥珀酸酐在DON的3位羥基上引入琥珀酸連接臂，采用活潑酯法在連接臂上偶聯(lián)牛血清蛋白BSA制備免疫抗原DON-HS-BSA。采用CDI法直接偶聯(lián)DON和卵清白蛋白OVA制備檢測抗原DON-OVA。通過紫外吸收光譜法和DON的ELISA檢測試劑盒鑒定偶聯(lián)成功。
　　試驗ⅡDON雜交瘤細胞的制備與

3、鑒定以DON-HS-BSA為抗原免疫BALB/c，取免疫后小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0進行融合，制備雜交瘤細胞，以O(shè)VA-DON為檢測抗原，采用間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞，使用有限稀釋法進行陽性細胞亞克隆。結(jié)果表明，免疫小鼠血清效價最高為1∶2000;篩選出1株穩(wěn)定分泌IgG2a，輕鏈為九鏈的DON雜交瘤細胞株。
　　試驗ⅢDON噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建、篩選和原核表達以DON雜交瘤細胞為基因來源，利用設(shè)計引物，經(jīng)RT

4、-PCR擴增小鼠IgG的重鏈、輕鏈可變區(qū)基因，并通過(Gly4Ser)3多肽Linker拼接VL-Linker-VH，并擴增得到單鏈抗體ScFv基因片段。利用SfiⅠ和NotⅠ雙酶切后連接ScFv基因和噬菌粒載體pCANTAB5E，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTG1，經(jīng)輔助噬菌體M13K07進行噬菌體拯救構(gòu)建DON噬菌體單鏈抗體庫。用DON檢測抗原進行phage-ELISA，對噬菌體重組抗體進行免疫親和、富集和篩選。結(jié)果表明，經(jīng)過三輪富集后