伏馬菌素B1和赭曲霉毒A噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及重組抗體蛋白的原核表達(dá).pdf

1、真菌毒素(Mycotoxin)是各種真菌產(chǎn)生的一系列有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于自然界中，并污染糧食谷物及各種農(nóng)產(chǎn)品。真菌毒素對(duì)人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展已經(jīng)構(gòu)成潛在威脅，它不僅降低產(chǎn)品質(zhì)量，而且可帶來嚴(yán)重的食源性中毒問題，引起人或動(dòng)物的急性、慢性中毒。動(dòng)物試驗(yàn)表明，攝入被真菌毒素污染的飼料后，就會(huì)引起人或動(dòng)物免疫抑制、組織壞死、肝腎損傷、繁殖障礙、致癌致畸等病理變化，影響人和動(dòng)物的身體健康。自然界存在的真菌毒素種類繁多、毒性復(fù)雜，由于其污染

2、廣泛、毒害范圍廣，在全球食品安全中受到高度關(guān)注。
　　 為了防止污染真菌毒素的食品及農(nóng)畜產(chǎn)品直接或間接的進(jìn)入人類食物鏈，加強(qiáng)對(duì)真菌毒素的檢測(cè)是十分必要的。近年來，真菌毒素的檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展，主要是以高效液相色譜法(HPLC)為主的色譜學(xué)檢測(cè)技術(shù)及以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)為主的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。色譜法檢測(cè)靈敏度高，但樣品質(zhì)量要求較高、前處理操作復(fù)雜;而以抗原抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法，由于其操作簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)一直被人們所青睞?，F(xiàn)

3、今，專家學(xué)者專注于優(yōu)化和改良ELISA方法，以提高ELISA方法的檢測(cè)性能。
　　 基因工程抗體技術(shù)是在充分認(rèn)識(shí)抗體的基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)發(fā)展起來的第三代抗體。基因工程抗體的研究意義在于可以有目的的對(duì)抗體基因進(jìn)行切割、拼接、修飾等一系列操作，獲得具有特異功能的改造抗體。與多克隆抗體和單克隆抗體相比，基因工程抗體制備具有時(shí)間周期短、操作簡(jiǎn)便、規(guī)模生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。單鏈抗體(ScAb)是基因工

4、程抗體中的一種，它的基因不易丟失，容易保存，作為傳統(tǒng)單克隆抗體的改良品，ScAb的具有較好的應(yīng)用前景，已成為免疫檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)方向。本研究以兩種常見的真菌毒素，赭曲霉毒素A(OTA)和伏馬菌素B1(FB1)為對(duì)象，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)及噬菌體展示技術(shù)，制備兩種真菌毒素的單鏈抗體，為其免疫學(xué)應(yīng)用與發(fā)展奠定基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)Ⅰ:伏馬菌素B1和赭曲霉毒素A完全抗原的合成與鑒定
　　 為了獲得FB1和OTA的抗體基因，本試驗(yàn)采

5、用戊二醛一步法將FB1與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)兩種載體蛋白偶聯(lián)，制備FB1完全抗原FB1-BSA和FB1-OVA;同時(shí)用碳二亞胺法合成OTA完全抗原OTA-BSA和OTA-OVA。隨后，分別采用紫外吸收光譜法（UV）、凝膠電泳法、傅里葉紅外光譜法(IR)、基質(zhì)輔助激光分析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)四種方法鑒定人工抗原偶聯(lián)效果并測(cè)定偶聯(lián)比。將FB1-BSA和OTA-BSA分別作為免疫抗原免疫BALB

6、/c小鼠，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(i-ELISA)，F(xiàn)B1-OVA和OTA-OVA分別作為固相包被抗原，測(cè)定小鼠抗血清滴度。結(jié)果表明，OTA和FB1完全抗原合成成功。MALDI-TOF-MS測(cè)定完全抗原FB1-BSA、FB1-OVA、OTA-BSA和OTA-OVA偶聯(lián)比分別為10∶1、5∶1、3∶1和9∶1。i-ELISA測(cè)定經(jīng)FB1-BSA和OTA-BSA免疫的小鼠血清效價(jià)均可達(dá)到1∶1.024×105。試驗(yàn)制備的完全抗原以及經(jīng)免疫的

7、小鼠可用于下一步試驗(yàn)。
　　 試驗(yàn)Ⅱ:伏馬菌素B1單鏈抗體可變區(qū)基因克隆與噬菌體抗體蛋白表達(dá)
　　 提取FB1雜交瘤細(xì)胞F3細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，應(yīng)用PCR技術(shù)分別將FB1鼠源抗體重鏈可變區(qū)基因（VH）和輕鏈可變區(qū)基因（VL）克隆出來，并經(jīng)過重疊延伸PCR（SOE-PCR），通過柔性多肽Linker接頭(Gly4Ser)3，按VH-Linker-VL方式拼接成FB1單鏈抗體可變區(qū)基因（ScFv）片段。

8、隨后將ScFv基因重組入pCANTAB5E載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coli宿主菌TG1中，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)，以FB1-OVA為固相包被抗原進(jìn)行免疫親和篩選，應(yīng)用Phage-ELISA和ScFv-ELISA鑒定和篩選陽性噬菌體重組單鏈抗體。將陽性pCANTAB5E-FB1 ScFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coli HB2151中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得FB1特異性噬菌體抗體(ScAb)。結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)鼠源單克隆抗體的重鏈、輕鏈可變區(qū)基因

9、引物，成功擴(kuò)增獲得FB1鼠源抗體的重鏈、輕鏈基因片段，大小為300～400 bp。SOE-PCR將VH和VL由Linker拼接成FB1 ScFv，大小為700～800 bp。隨后將ScFv基因重組入pCANTAB5E載體中，轉(zhuǎn)化至E.coli TG1中，經(jīng)過輔助噬菌體M13K07感染，構(gòu)建得到的FB1噬菌體重組單鏈抗體庫，抗體滴度約為2.1×1015 cfu·mL-1。經(jīng)過五輪免疫親和富集和篩選，成功篩選得到5株可分泌FB1特異性噬菌體

10、單鏈抗體的菌株。核苷酸序列鑒定顯示該序列為717 bp，編碼239個(gè)氨基酸。在M13K07輔助噬菌體的輔助下，pCANTAB5E噬菌體質(zhì)?？僧a(chǎn)生含有FB1單鏈?zhǔn)删w基因組的噬菌體顆粒，并以融合的形式表達(dá)在噬菌體表面。在E.coli HB2151中，F(xiàn)B1ScFv基因在翻譯過程中形成獨(dú)立的抗體蛋白，以胞周間質(zhì)形式形成可溶性蛋白。
　　 試驗(yàn)Ⅲ:赭曲霉毒素A單鏈抗體可變區(qū)基因克隆與噬菌體抗體蛋白表達(dá)
　　 用OTA-BSA免

11、疫BALB/c小鼠，免疫效價(jià)達(dá)到要求后，提取小鼠脾總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，應(yīng)用PCR技術(shù)分別克隆OTA鼠源抗體VH和VL，并經(jīng)過SOE-PCR，通過柔性多肽Linker接頭，按VH-Linker-VL方式拼接成OTA ScFv片段。隨后將ScFv基因重組入pCANTAB5E載體中，轉(zhuǎn)化至E.coli TG1中，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)，以O(shè)TA-OVA為固相包被抗原進(jìn)行免疫親和篩選，應(yīng)用Phage-ELISA和ScFv-ELIS

12、A鑒定和篩選陽性噬菌體重組單鏈抗體。將陽性pCANTAB5E-OTA ScFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coli HB2151中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得OTA特異性ScAb。結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)鼠源單克隆抗體的重鏈、輕鏈可變區(qū)基因引物，成功擴(kuò)增獲得OTA鼠源抗體的VH和VL，大小為300～400 bp。SOE-PCR將VH和VL由Linker拼接成ScFv，大小為700～800 bp。隨后將ScFv基因重組入pCANTAB5E載體中，轉(zhuǎn)化至E co

13、li TG1中，經(jīng)過輔助噬菌體M13K07感染，構(gòu)建得到的OTA噬菌體重組單鏈抗體庫，抗體滴度約為2.65×1016cfu·mL-1。經(jīng)過三輪免疫親和富集和篩選，成功篩選得到3株可分泌OTA特異性噬菌體單鏈抗體的菌株。核苷酸序列鑒定顯示該序列為738 bp，共編碼246個(gè)氨基酸。在pCANTAB5E噬菌體質(zhì)粒中，OTA ScFv以胞周間質(zhì)形式形成可溶性蛋白。
　　 試驗(yàn)Ⅳ:伏馬菌素B1和赭曲霉毒素A單鏈抗體特性鑒定
　　

14、 應(yīng)用蛋白免疫印跡(WB)和i-ELISA方法分別鑒定OTA與FB1兩種真菌毒素ScAb的免疫活性。應(yīng)用i-ELISA分別測(cè)定OTA與FB1 ScAb的效價(jià)。應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ci-ELISA)建立競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別測(cè)定OTA和FB1 ScAb的靈敏度，并測(cè)定OTA，F(xiàn)B1 ScAb與參試毒素FB2、FB3、AFB1、ZEA和DON交叉反應(yīng)率，以反映其特異性。結(jié)果顯示，WB和i-ELISA均顯示OTA與FB1 ScAb具

15、有良好的免疫活性。FB1-OVA抗原最佳工作濃度為5μg·mL-1，ScAb最佳稀釋度為1∶1600; OTA-OVA抗原最佳工作濃度為10μg·mL-1，ScAb最佳稀釋度為1∶800;FB1ScAb抗體滴度達(dá)到104; OTA ScAb抗體滴度達(dá)到103; ci-ELISA法繪制FB1競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，F(xiàn)B1濃度為0.31～20μg·mL-1范圍內(nèi)曲線線性關(guān)系良好，線性方程為y=-16.663x+117.98(R2=0.9674)，F(xiàn)B

16、1 ScAb對(duì)FB150％抑制濃度4.08μg·mL-1;同樣方法繪制OTA競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，OTA濃度為0.31～10μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=-16.075x+116.84(R2=0.9797)，OTA ScAb對(duì)OTA的50％抑制濃度4.16μg·mL-1。FB1ScAb對(duì)FB1同種屬的FB2、FB3的交叉反應(yīng)抑制率分別為71.7％和87.6％，而與DON、AFB1、OTA和ZEA交叉反應(yīng)抑制率較小，說明該FB1