伏馬菌素B1和黃曲霉毒素B1聯(lián)合誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、伏馬菌素是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的一種水溶性的霉菌毒素,其中FB1是伏馬菌素的主要組成部分,同時也是導(dǎo)致伏馬菌素毒性的主要原因。FB1廣泛存在于玉米及其制品中,對人類的健康以及畜牧業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了潛在的威脅。在體內(nèi)、體外的研究中,FB1的毒性作用已經(jīng)得以證實(shí),包括肝、腎毒性,肺水腫,神經(jīng)毒性,免疫抑制,以及致癌性等。研究表明FB1也具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,但是目前關(guān)于FB1對細(xì)胞毒性研究的報道比較少,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的報道也不多。同時

2、AFB1是由黃曲霉菌與寄生曲霉菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物,也是目前已知的毒性最強(qiáng)的毒素,廣泛存在于各種谷物和飼料中,而且還有致突變作用和致DNA損傷的作用,AFB1還能夠引起誘發(fā)性肝癌,使肝臟廣泛出血、壞死,對腎臟也有明顯的損壞作用。鑒于兩種毒素都廣泛存在于各種谷物及其制品中,并且都能夠產(chǎn)生腎毒性,所以本試驗(yàn)以FB1敏感細(xì)胞Vero細(xì)胞作為研究對象,經(jīng)FB1和AFB1的單獨(dú)和聯(lián)合作用后,觀察對Vero細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞的活性、線粒體膜電位

3、以及凋亡時相關(guān)蛋白表達(dá)的變化的影響,探討兩種毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制以及兩者的聯(lián)合作用,為深入研究FB1的毒性機(jī)理以及FB1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)一:
　　 本試驗(yàn)將處于對數(shù)期生長的Vero細(xì)胞以不同濃度的FB1和AFB1,以及兩者的聯(lián)合濃度進(jìn)行處理,并設(shè)置空白培養(yǎng)基作為對照組。24 h后,采用MTT法測定各濃度組毒素對Vero細(xì)胞的毒性作用；于倒置顯微鏡下觀察Vero細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的變化；用瓊脂糖

4、凝膠電泳來檢測其DNA的完整性。結(jié)果顯示:MTT法測定毒素對Vero細(xì)胞的增殖抑制率中,在作用時間相同的情況下,FB1和AFB1兩種毒素單獨(dú)作用時,隨著毒素濃度的加大,細(xì)胞的增值抑制率也逐漸增大；當(dāng)FB1分別與AFB1的兩個濃度聯(lián)合時,FB1的細(xì)胞增殖抑制率比單獨(dú)時的抑制率都高,其IC50也顯著的降低。形態(tài)學(xué)上的變化顯示,FB1從2500 ng·mL-1開始對Vero細(xì)胞產(chǎn)生較明顯的凋亡作用,AFB115、30 ng·mL-1兩個濃度對

5、Vero細(xì)胞都具有誘導(dǎo)凋亡的作用,其中各濃度毒素組細(xì)胞的凋亡率都是顯著高于對照組的；瓊脂糖凝膠電泳后,各試驗(yàn)組的細(xì)胞均形成DNA ladder,證明細(xì)胞的DNA發(fā)生了斷裂,引起了細(xì)胞的凋亡。
　　 試驗(yàn)二:
　　 本試驗(yàn)將處于對數(shù)期生長的Vero細(xì)胞以不同濃度的FB1和AFB1,以及兩者的聯(lián)合濃度進(jìn)行處理,并設(shè)置空白培養(yǎng)基作為對照組。24h后,經(jīng)JC-1染色后,用流式細(xì)胞儀來檢測線粒體膜電位的變化情況。結(jié)果顯示:線粒體膜

6、電位的檢測中,在作用時間相同的情況下,FB1單獨(dú)時,從濃度2500 ng·mL-1開始與對照組相比差異顯著,并且隨著FB1濃度的逐漸增大,線粒體膜電位的下降程度也越來越明顯,15 ng·mL-1 AFB1低濃度聯(lián)合組以及30 ng·mL-1 AFB1高濃度聯(lián)合組中線粒體膜電位的下降程度都比FB1單獨(dú)時下降的大。
　　 試驗(yàn)三:
　　 本部分試驗(yàn)采用免疫蛋白印跡(Western Blotting)檢測FB1和AFB1單獨(dú)和