矽肺大鼠噬菌體單鏈抗體庫構(gòu)建與矽肺相關(guān)抗體篩選.pdf

1、目的:
　　大量研究表明矽肺病的發(fā)生發(fā)展過程與機(jī)體免疫功能的變化密切相關(guān)，包括非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫等均發(fā)揮了重要作用。矽塵是一種半抗原，可有選擇地吸附體內(nèi)物質(zhì)組成復(fù)合抗原，巨噬細(xì)胞損傷或凋亡釋放的脂蛋白等可成為自身抗原，因此塵肺的肺組織具有復(fù)雜的抗原成分。國(guó)內(nèi)外學(xué)者均觀察到矽肺病患者機(jī)體體液免疫功能明顯增強(qiáng)，而矽肺患者細(xì)胞免疫功能大多降低。以往研究表明，接塵工人、矽肺患者體內(nèi)存在病理情況下才出現(xiàn)的的抗體即自身抗體，但由

2、于技術(shù)限制，僅對(duì)某一或某些抗體進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)某些期別、某個(gè)階段的抗體進(jìn)行了探討，尚缺乏對(duì)矽肺病免疫抗體改變的全譜、全程、系統(tǒng)的觀察研究。
　　隨著近年來細(xì)胞免疫學(xué)、分子免疫學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，抗體庫技術(shù)越來越成熟，為探討矽肺免疫抗體在塵肺的發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的途徑和方法。噬菌體展示技術(shù)是以噬菌體外殼蛋白 PⅢ或 PⅧ基因?yàn)檩d體，在噬菌體中插入一段需要表達(dá)的基因片段，該外源基因片段可以在噬菌體表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空

3、間構(gòu)象表達(dá)相應(yīng)的蛋白。利用隨機(jī)短肽與絲狀噬菌體的表面蛋白 PⅢ融合，并展示在噬菌體表面，首次建立了噬菌體隨機(jī)肽庫以來，噬菌體展示技術(shù)運(yùn)用已經(jīng)相當(dāng)成熟，關(guān)于人源塵肺病噬菌體單鏈抗體庫構(gòu)建課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建，篩選出了幾種煤工塵肺相關(guān)抗原抗體，并驗(yàn)證了其在接塵工人和煤工塵肺病患者血液中的表達(dá)，考慮到煤工塵肺患者接觸的為混合性粉塵，且人群免疫反應(yīng)較為復(fù)雜，影響因素較多，采用單一性二氧化硅粉塵構(gòu)建大鼠矽肺模型，建立相對(duì)較為特異的矽肺噬菌體單鏈

4、抗體庫并從中篩選出矽肺相關(guān)抗體具有重要意義。
　　方法:
　　1.構(gòu)建大鼠矽肺模型：對(duì)大鼠進(jìn)行二氧化硅懸液肺灌注，采用非氣管暴露法經(jīng)口間斷注入二氧化硅懸液1ml（含SiO2100mg），注意觀察其活動(dòng)狀態(tài)，灌注完成后輕撫大鼠胸部使粉塵分散至全肺，并使大鼠盡快解除窒息，以相同方法灌注1ml生理鹽水作為對(duì)照組。分別在3、6、9、12周每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各處死6只，取組織樣本和外周血備用。
　　2.擴(kuò)增單鏈抗體基因：提

5、取矽肺模型構(gòu)建成功的大鼠外周血，用大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液提取淋巴細(xì)胞，Triozl法提取單核細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用兼并引物經(jīng)PCR擴(kuò)增抗體輕重鏈可變區(qū)基因，使用帶有粘端的Linker將輕重鏈可變區(qū)連接成單鏈抗體。
　　3.構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫：將單鏈抗體和噬菌粒載體 PCANTAB-5e進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行拼接，然后轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌TG1，經(jīng)輔助噬菌體超感染，最終構(gòu)建成大鼠矽肺噬菌體單鏈抗體庫。

6、>　　4.對(duì)大鼠矽肺噬菌體單鏈抗體庫富集篩選：提取模型大鼠肺組織蛋白和對(duì)照組肺組織蛋白，對(duì)已構(gòu)建好的噬菌體單鏈抗體庫進(jìn)行4輪富集篩選，測(cè)定其庫容量。
　　5.矽肺噬菌體單鏈抗體特異性檢測(cè)：隨機(jī)選取最后一輪篩選后抗性平板上菌落20個(gè)，提取質(zhì)粒包被在酶標(biāo)板中，ELISA檢測(cè)矽肺大鼠(P)和對(duì)照組(N)肺組織蛋白OD450值，以P/N>2.0為陽性克隆。
　　6.對(duì)陽性克隆鑒定：將陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行

7、 BLAST比對(duì)，然后將測(cè)序結(jié)果翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列并對(duì)翻譯結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.利用噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了庫容量為7.2×109cfu/L的初級(jí)噬菌體單鏈抗體庫。
　　2.以提取的矽肺模型肺組織蛋白為靶蛋白，利用噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)4輪富集篩選，成功篩選出具有較高親和力的抗矽肺大鼠的噬菌體單鏈抗體庫，通過ELISA方法，并經(jīng)核酸測(cè)序及BLAST比對(duì)，從中篩選出3個(gè)大鼠矽肺模型相關(guān)抗體，分別是抗IFN-