豬源噬菌體抗體庫的構(gòu)建與抗PRRSV抗體的篩選.pdf

1、中和抗體能夠與病毒表面的抗原結(jié)合，從而阻止病毒吸附靶細(xì)胞受體，防止病毒侵入細(xì)胞，在抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。因此，中和抗體是一種具有很好應(yīng)用前景的抗病毒治療制劑。但是，采用小鼠單克隆抗體技術(shù)制備的抗病毒中和抗體對于人或畜禽等動物存在異源性等特性，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制。近年來，隨著抗體制備技術(shù)的發(fā)展，制備人源或動物源的中和抗體成為研究熱點(diǎn)。目前，針對人類免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、登革熱病毒等多種病毒的全人源中和抗體開發(fā)取得了顯

2、著進(jìn)展，而且還發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)可能存在具有抗病毒中和作用的天然中和抗體。相對于人源中和抗體研究，豬等動物源中和抗體的開發(fā)尚處于起步階段。
　　豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS Virus，PRRSV)引起的妊娠母豬繁殖障礙、仔豬嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)癥狀和生長遲緩等臨床表現(xiàn)的病毒性傳染病。PRRSV感染或免疫能誘發(fā)很強(qiáng)的體

3、液免疫反應(yīng)，一般于感染后7～9d可檢測到特異性抗體，但這些抗體對體內(nèi)、外的病毒都沒有中和能力甚至?xí)鰪?qiáng)感染，而有效的中和抗體一般出現(xiàn)于28d以后。由于中和抗體產(chǎn)生的時(shí)間晚、水平低，使該病的防治十分困難。為深入研究豬對PRRSV的抗體反應(yīng)，本研究利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了豬源抗體庫，并從中篩選到具有中和能力的抗體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)篩選到的中和抗體為多反應(yīng)性抗體，主要結(jié)合細(xì)胞蛋白KRT8(Keratin8)和MYH9(Nonmuscle myo

4、sin heavy chainⅡ-A)。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.豬源天然抗體庫的構(gòu)建與抗PRRSV抗體的篩選
　　分離PRRSV抗原、抗體陰性豬的PBMCs(Peripheral BloodMononuclear Cells)，提取mRNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到抗體重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)基因，通過overlap PCR將VH、VL用一條柔性多肽基因組裝成scFv(single-chain anti

5、body)片段。噬粒pComb3XSS與scFv片段經(jīng)SfiⅠ酶切、回收、連接、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得庫容為1.5×108的初級庫，經(jīng)鑒定插入片段大小的正確率為80％。通過測序發(fā)現(xiàn)VH序列的相似度介于63.3％～92.5％，未發(fā)現(xiàn)相同序列，說明抗體庫的多樣性好。與IMGT數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)天然庫VH基因家族的分布符合文獻(xiàn)報(bào)道的最多的3個(gè)基因家族占比＞40％，最多的6個(gè)基因家族占比＞70％的規(guī)律，而且天然庫的VH基因分布于13個(gè)不同的基因家族

6、，進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建的天然庫具有很好的多樣性。加入輔助噬菌體超感染獲得重組噬菌體抗體庫，用純化的PRRSV病毒粒子進(jìn)行篩選，獲得4株噬菌體抗體N-28、N-36、N-48、N-67。將獲得的抗體基因連接至pET-22b表達(dá)載體，經(jīng)鑒定重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。對包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性后，測定了4株抗體中和PRRSV的能力，發(fā)現(xiàn)其中N-28、N-67具有一定的中和PRRSV的能力。
　　2.豬源PRRSV免疫抗體庫的構(gòu)建與抗PRRS

7、V抗體的篩選
　　為篩選具有廣譜抗PRRSV的中和抗體，首先用PRRSV商品化弱毒活疫苗免疫30日齡仔豬，然后用高致病性PRRSV毒株（WUH3株）、兩種美國流行毒株(VR2385、VR2549)、國內(nèi)分離的流行毒株(NADC30L)對仔豬進(jìn)行感染。經(jīng)過8次免疫/感染后，實(shí)驗(yàn)豬體內(nèi)產(chǎn)生了針對PRRSV WUH3株、VR2385株、VR2549株和NADC30L株的高滴度中和抗體，中和效價(jià)介于1∶63.5～1∶858.7之間。分離高

8、免疫豬的PBMCs，擴(kuò)增抗體基因，經(jīng)過多次電轉(zhuǎn)獲得庫容為2×107的初級庫，經(jīng)鑒定插入片段大小的正確率為89.4％。通過測序發(fā)現(xiàn)VH序列的相似度介于70.3％～93.5％，未發(fā)現(xiàn)相同序列，說明免疫抗體庫的多樣性好;VH基因家族則由天然庫的13個(gè)下降為6個(gè)，說明經(jīng)過多次免疫/感染后試驗(yàn)豬的抗體基因使用率發(fā)生了明顯的變化。用純化的PRRSV病毒粒子對構(gòu)建的抗體庫進(jìn)行富集、篩選，最終獲得3株噬菌體抗體Ⅰ-2154、Ⅰ-1320、Ⅰ-141。將

9、抗體基因連接至原核表達(dá)載體pET-22b中，表達(dá)純化后測定了3株抗體對PRRSV WUH3株、VR2549株、NADC30L株的中和能力，結(jié)果表明3株抗體對3株病毒均有一定的中和作用，其中Ⅰ-141的中和效果最好。3株病毒對抗體的敏感度也不相同，其中NADC30L對Ⅰ-141最為敏感。進(jìn)一步分析了Ⅰ-141對NADC30L的抑制機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Ⅰ-141并不影響病毒的吸附而是抑制了病毒的侵入。
　　3.scFv結(jié)合蛋白的質(zhì)譜鑒定與功能研

10、究
　　首先用生物素標(biāo)記的N-28、Ⅰ-141分別與感染或不感染PRRSV的MARC-145細(xì)胞裂解液孵育，用鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠分離與scFv結(jié)合的蛋白，然后對分離的蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果檢索PRRSV WUH3編碼蛋白，在2個(gè)接毒組中均未能鑒定到病毒蛋白;對4個(gè)實(shí)驗(yàn)組鑒定到的蛋白分析發(fā)現(xiàn)有30種蛋白在4個(gè)實(shí)驗(yàn)組均能被鑒定到，提示N-28、Ⅰ-141可能為多反應(yīng)性抗體。為了確認(rèn)這兩株scFv的多反應(yīng)性，選擇了KRT8、