人源天然Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗c-Met抗體的篩選、鑒定.pdf

1、上世紀(jì)80年代，met作為原癌基因被首次發(fā)現(xiàn)。其表達(dá)產(chǎn)物c-Met是一類酪氨酸激酶受體，唯一的配體是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/擴(kuò)散因子(HGF/SF)。c-Met在大多數(shù)實(shí)體腫瘤以及白血病均明顯高表達(dá)，且與腫瘤臨床預(yù)后不良高度相關(guān)。HGF/SF、c-Met在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和腫瘤血管生成。c-Met也因此成為抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。目前已開(kāi)展的針對(duì)HGF/SF和c-Met的腫瘤治療包括，反義核酸分子、

2、小分子RNA、HGF/SF拮抗劑NK4、c-Met抑制劑sU11274等，以及抗c-Met或抗HGF/SF的抗體等。 抗體由于其對(duì)相應(yīng)靶抗原具有高度的特異性并能偶聯(lián)其它抗腫瘤藥物結(jié)合到靶抗原分子而成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。在臨床治療中，人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)等缺點(diǎn)影響了鼠源性單抗的應(yīng)用，因此研制全人源抗體成為重要的發(fā)展方向。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是制備全人源抗體的主要技術(shù)平臺(tái)。大容量、具有良好多樣性的抗體庫(kù)，是獲得各種人源抗體的有

3、效途徑，而且對(duì)獲得高親和力抗體以及在對(duì)抗體性能進(jìn)行改造方面具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。本文應(yīng)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，克隆出全套人抗體基因，并在噬茵體表面表達(dá)，構(gòu)建大容量人源天然Fab抗體庫(kù)，從中篩選出特異性抗c-Met全人源Fab抗體片段，為抗腫瘤藥物的研制提供新的候選分子。 研究方法 1.取20位健康成人骨髓分離后的淋巴細(xì)胞，抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以25對(duì)人源抗體基因引物擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因；從兩個(gè)重組載體pComb3XTT和

4、pComb3Xλ將重鏈CH1、輕鏈恒定區(qū)CL基因分別擴(kuò)出。再經(jīng)2輪Overlap-PCR連接得Fab基因。Fab基因和pComb3XSS載體各經(jīng)SfiⅠ酶切后，進(jìn)行二者連接。通過(guò)多次電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E.coli.XL1-Blue菌，得到人源天然Fab噬菌體抗體庫(kù)。 2. 以固相化蛋白對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行6輪篩選，隨機(jī)挑選60個(gè)克隆用Phage ELISA進(jìn)行鑒定。陽(yáng)性者經(jīng)Bst0Ⅰ酶切片段分析為不同克隆的，行測(cè)序分析，并轉(zhuǎn)化入E.coli.T