人源Naive Fab抗體庫的構(gòu)建和抗Met抗體片斷的篩選及特征鑒定.pdf

1、南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人源NaiveFab抗體庫的構(gòu)建和抗Met抗體片斷的篩選及特征鑒定姓名：焦永軍申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：管曉虹曹伯良20050417南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)住論文我們設(shè)計(jì)并構(gòu)建了庫容為2。0109的大容量人源NaiveFab抗體庫，并應(yīng)用生物篩選法從中成功地篩選出一株抗Met人源抗體分子，該分子被命名為hFabMet一1。hFabMeti的生物學(xué)特性及功能已被詳細(xì)鑒定，具體內(nèi)容概括如下。買驗(yàn)一人源Na

2、iveFab抗體庫的構(gòu)建1Fab基因的克隆收集15人份臨床檢驗(yàn)后剩余的成人骨髓，分離淋巴細(xì)胞，抽提純化總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。3輪PCR擴(kuò)增出編碼抗體Fab片斷的基因庫。以cDNA為模板擴(kuò)增抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因；重鏈C眥、輕鏈恒定區(qū)cL基因分別來自pComb3XTT和pComb3X％兩個(gè)重組載體；以O(shè)verlap—PCR分別連接重輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)基因；最后再以O(shè)verlap—PCR連接重鏈Fd段基因和輕鏈全長基因而獲得Fab

3、基因。2人源NaiveFab抗體庫的構(gòu)建Fab基因和pComb3xsS載體分別經(jīng)SfiI酶切后，進(jìn)行二者連接。重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌一XLlblue進(jìn)行抗體庫構(gòu)建。通過優(yōu)化可影響轉(zhuǎn)化效率的參數(shù)，如轉(zhuǎn)化溫度，電擊條件的設(shè)置，電擊后樣品的處理及DNA樣品的準(zhǔn)備等，使得每一次轉(zhuǎn)化可獲得20107個(gè)轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過約100次電轉(zhuǎn)化，我們獲得了庫容為20109全人源Naive抗體庫。DNA鋇q序結(jié)果表明大于86％(I3／I5)的克隆含有

4、插入方向正確的全長Fab基因序列。實(shí)驗(yàn)二人源NaiveFab抗體庫的篩選及抗MetFab抗體片斷的特征鑒定1抗MetFab抗體片斷的篩選為了使所篩出的抗Met抗體具有腫瘤治療的潛能，我們以表達(dá)于活體細(xì)胞s114表面的Met分子為靶標(biāo)進(jìn)行篩庫?？贵w庫首先與S114的前體細(xì)胞NIH3T3(Met一)作用以去除一些非相關(guān)抗體的富集，然后再以s114細(xì)胞(Met)為靶細(xì)胞進(jìn)行篩庫。這種篩庫方式的目的有二：期望使得篩出的抗體能在體內(nèi)與具有特定空間

5、構(gòu)像的Met分子結(jié)合；提高了Met特異性抗體的富集效率。經(jīng)過7輪篩選，隨機(jī)調(diào)取504“克隆以PhageELISA進(jìn)行鑒定，17個(gè)為陽性。其中10個(gè)克隆的DNAj91q序結(jié)果表明它們?yōu)閱我豢寺?，命名為hFabMet1。2hFab—Met一1的特征鑒定及功能分析hFab—Met一1經(jīng)表達(dá)、純化后，其特異性通過ELIsA，免疫沉淀，免疫轉(zhuǎn)印和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，hFabMet1能夠與具有特定空間構(gòu)像的Met分子胞外結(jié)構(gòu)域特異性