脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對人外周血淋巴細胞的遺傳毒性研究.pdf

1、霉菌毒素是由霉菌或真菌產生的有毒有害的二級代謝產物。在土壤中、植物上、谷物、飼草和青貯飼料等均可發(fā)現(xiàn)霉菌毒素。霉菌毒素可在農作物收獲時形成。在不適宜的貯存條件下,霉菌毒素也可繼續(xù)在收獲后的農作物上形成。世界上每年大約有25％谷物遭受各種霉菌污染,因污染程度不同,不同地區(qū)差距很大,而中國是霉菌毒素污染的重災區(qū)之一。
　　脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱嘔吐毒素,它能夠對人體健康造成極大的傷害。它主要是由鐮刀菌的某些種菌產生的化學結構和生物活性

2、相似的有毒代謝產物——單端孢霉烯族化合物中的一種。DON的主要產生菌是禾谷鐮刀菌,據(jù)報道也有其它一些鐮刀菌可產生。DON屬于劇毒類,以往的研究中表明:DON在體內可能有一定的蓄積,且具有很強的細胞毒性,但無特殊的靶器官。人畜誤食了被DON污染的食物/飼料后,會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應遲鈍等急性中毒癥狀,嚴重時會損害造血系統(tǒng)造成死亡。
　　目前,在食品安全和基礎毒理學研究(致畸)中也發(fā)現(xiàn),DON能夠在很多的食品中以

3、極低的含量檢測出。如大、小麥制品可檢出1ppm的DON含量、4月齡雞肉中可檢測出10ppm的DON含量,豬肉中可檢出5ppm的DON含量以及酒類中均能檢測出DON的存在。毒理學研究指出:100ng/mL的DON能導致細胞分裂指數(shù)下降、細胞炎性物質過度表達和細胞出現(xiàn)凋亡的情況。低劑量的DON能造成V79細胞出現(xiàn)微核及染色體畸變;經口灌服(1000mg/kg)能致使胎鼠和仔雞的骨骼畸形和小鼠生殖細胞數(shù)量下降以及細胞形態(tài)發(fā)生畸形。綜上所述,不

4、同劑量的DON能致使動物臟器和細胞受到不同程度的損傷,特別是生殖細胞的數(shù)量和活力的下降,這也提示了,DON可能具有潛在的細胞毒性和遺傳毒性。然而,迄今為止,文獻中關于DON對人原代細胞是否有遺傳毒性和其毒性的分子毒理學的研究還比較少。
　　因此,本研究的目的在于:利用人外周血淋巴細胞作為實驗對象,觀察DON對人原代細胞的細胞毒性和遺傳毒性。并利用分子生物學技術對細胞毒性和遺傳毒性進行分子層面的研究。
　　第一部分脫氧雪腐鐮刀

5、菌烯醇導致人外周血淋巴細胞的遺傳毒性研究
　　目的:以人外周血淋巴細胞為研究對象,觀察DON對人淋巴細胞的細胞活力抑制作用(IC50)、對人淋巴細胞DNA的損傷作用,以及對人淋巴細胞染色體損傷的作用。方法:(1)志愿者均為健康人員,血樣采集前需經過知情同意書的填寫和個人健康狀況的詢問,包括:是否在近期接受過藥物治療、是否有遺傳病和傳染病以及是否有不良嗜好(抽煙或酗酒)等。(2)全血樣本用淋巴細胞分離液分離提取淋巴細胞,隨后用PRM

6、I1640培養(yǎng)液重懸,并接種于細胞培養(yǎng)板。(3)利用CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)試劑盒檢測細胞活力,并計算IC50數(shù)值。(4)利用單細胞凝膠電泳法,檢測DON對淋巴細胞 DNA的損傷程度。(5)在微核試驗中利用細胞松弛素-B阻滯法檢測DON暴露下的淋巴細胞微核的產生情況。(6)利用姐妹染色體交換法,觀察DON造成人淋巴細胞染色體損傷的程度。結果:(1)在

7、染毒DON24h后,細胞活力從98.07±0.10％(0ng/mLDON)下降到14.03±1.78％(500ng/mLDON)(P<0.01)。兩性細胞樣本的IC50為:男---103.7±2.83ng/mL;女---101.4±3.15ng/mL,男性樣本和女性樣本的IC50之間無性別差異(P>0.05)。(2)在染毒24h后,與陰性對照組相比,DON組的Tail length、Tail DNA％和Tail moment的數(shù)值明顯增

8、加(P<0.01)。(3)微核試驗的結果顯示,DON的暴露能明顯增加人淋巴細胞中微核的數(shù)量。染毒組微核數(shù)量明顯高于陰性對照組(23.86±4.11‰,0ng/mL DONvs109.66±9.81‰,50ng/mLDON,24h,P<0.01)。(4)姐妹染色體交換的結果表明,與陰性對照組相比,DON暴露24 h后能明顯的破壞染色體結構,使染色體缺失或畸形的數(shù)量明顯上升(62±13.01/30cells,0ng/mL DONvs206.

9、17±18.40/30cells,50ng/mLDON,24h,P<0.01)。結論:(1)DON的暴露能明顯抑制人淋巴細胞的細胞活力。提示DON具有潛在的細胞毒性。(2)人淋巴細胞暴露于DON環(huán)境中,細胞的DNA損傷程度、微核數(shù)量以及染色體損傷數(shù)量明顯增加。提示DON具有潛在的遺傳毒性特征。
　　第二部分脫氧雪腐鐮刀菌烯醇導致人外周血淋巴細胞氧化應激的機制研究
　　目的:以人外周血淋巴細胞為研究對象,探討DON造成的氧化應

10、激與DNA損傷和染色體損傷之間的關系。方法:(1)人群血樣采集與細胞提取過程和培養(yǎng)方法參照第一部分。(2)利用高效液相色譜法對DON導致人外周血淋巴細胞脂質過氧化的產物進行定性及定量分析。(3)利用高效液相色譜-電噴霧質譜聯(lián)用法對GSH含量及GSSG的含量進行定量和定性分析。(4)利用熒光探針法(DCFH-DA)裝載細胞培養(yǎng)基,對細胞中ROS的含量進行定量分析,并利用激光共聚焦顯微鏡對細胞內ROS進行熒光定性分析。(5)利用Annexi

11、n V-FITC探針法裝載細胞后,在流式細胞儀中對膜損傷情況進行定量分析。(6)利用ELISA法檢測DNA氧化性損傷標志物(8-OHdG)在人淋巴細胞中的含量,對DNA損傷進行初步的評估。結果:(1)人外周血淋巴細胞染毒DON后(24h),與陰性對照組相比,DON組的MDA的含量明顯上升。(2)人外周血淋巴細胞染毒DON后(24h),與陰性對照組相比,DON組中GSH的含量明顯下降,GSSG的含量隨之升高。(3)人外周血淋巴細胞染毒DO

12、N后(24h),與陰性對照組相比,ROS熒光探針的熒光強度隨時間-劑量而增強。并且在激光共聚焦顯微鏡成像圖中,可以觀察到細胞內熒光強度增強,細胞形態(tài)由正常形態(tài)逐漸變的固縮及變形,細胞膜逐漸失去光澤并呈現(xiàn)出不規(guī)則表面。(4)在DON暴露24h后,FITC探針與細胞膜磷脂結構的結合強度明顯增強。(5)DON暴露24h后,染毒組8-OHdG的含量明顯高于陰性對照組。結論:(1)DON能造成氧自由基的增多削弱抗氧化酶的活力,致使細胞內(膜)的過

13、氧化加劇。(2)細胞壞死的數(shù)量和細胞膜變形,可能與DON造成的氧自由基增高有關。(3)由于DON使8-OHdG的含量明顯上升,提示DON導致人淋巴細胞的細胞毒性和遺傳毒性與DON導致DNA氧化性損傷有關。
　　第三部分脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對人外周血淋巴細胞遺傳毒性的分子毒理學機制
　　目的:以人淋巴細胞染毒DON為體外模型,利用分子生物學技術進一步探討DON對人淋巴細胞遺傳毒性的分子毒理學機制。方法:(1)人群血樣采樣和細胞培

14、養(yǎng)方法均與第一部分相同。(2)利用RT-PCR法,測定人淋巴細胞在染毒DON6、12和24h后的DNA修復相關基因的mRNA的表達水平。(3)利用Western-Blot法檢測堿基切除修復關鍵基因hOGG1和XRCC1的蛋白表達水平。(4)利用Western-Blot法檢測HO-1的蛋白表達水平。結果:(1)RT-PCR的結果顯示,DNA修復相關基因和HO-1均在6h時表達明顯高于陰性對照組(P<0.01),并在染毒12h時,出現(xiàn)下降的

15、趨勢(P<0.05)。在24h時,與陰性對照組無顯著性差異(P>0.05)。(2)Western-Blot的結果提示,與陰性對照組相比,堿基切除修復機制中的關鍵基因hOGG-1和XRCC1的蛋白表達水平在短時間內明顯升高(P<0.01)。而在12h時,hOGG-1的蛋白表達水平逐漸下降(P<0.05),XRCC-1卻沒有顯著性差異(P>0.05)。在24h時,hOGG-1和XRCC1的蛋白表達水平均與陰性對照組無明顯差異(P>0.05)

16、。(3)Western-Blot的結果表明,染毒6、12和24h后,與陰性對照組相比,HO-1的蛋白表達水平在6h時明顯升高(P<0.05)。但在染毒12和24小時后,沒有顯著性差異(P>0.05)。結論:(1)結果提示,DON能夠在短時間內刺激DNA修復能力的提升,但DON濃度的增加和染毒時間的延長會抑制DNA修復能力。(2)Western-Blot的結果表明hOGG-1、HO-1和XRCC-1在6h時,有表達上調的現(xiàn)象。而在12和2

17、4h時,與陰性對照組相比較無明顯差異。HO-1的表達抑制可能與DNA修復能力下降有關。
　　本研究的創(chuàng)新之處：
　　(1)本研究驗證了DON能夠對人外周血淋巴細胞造成遺傳毒性。(2)本研究從DNA損傷/修復和氧化應激兩方面探討DON遺傳毒性的分子毒理學機制,進而證明氧化應激與DON的遺傳毒性有關。(3)DON可能通過抑制HO-1的表達,造成淋巴細胞內高氧化應激狀態(tài)而導致DNA損傷。進而證明HO-1可能是DON導致人外周血淋巴