脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的胚胎毒性及胎盤氧化應(yīng)激所起作用.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是糧谷類食物重要的污染物之一，其在大麥、小麥、玉米以及其他谷類作物中含量最高，而農(nóng)副產(chǎn)品（如啤酒、面包、雞蛋、牛奶和肉類等）中也有檢出。DON是單端孢霉烯族化合物B型中的一員，該族化合物已被證實由食物與環(huán)境中的鐮刀菌、葡萄穗霉菌以及漆斑菌等在生長過程中產(chǎn)生，并且其引起的食物中毒事件一直是全球食品安全工作者關(guān)注的重點之一。DON很難被一般的烹調(diào)和加熱降解，即其毒性在一般情況下很難被

2、破壞，因此其在食品和環(huán)境中具有極高的殘留濃度，一旦形成將通過食物鏈的傳遞對人體和動物的健康產(chǎn)生巨大威脅。
　　就目前的研究來看，DON可在多個物種體內(nèi)引起多器官的損傷，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、拒食、腹瀉、消化紊亂以及體重減輕等相對較輕微的反應(yīng)，也可引起皮膚損傷，免疫抑制甚至骨髓破壞等嚴(yán)重不良反應(yīng)。從另一方面來說，DON在體內(nèi)無特殊的靶器官，但具有很強的細胞毒性。同時DON具有多種生物毒作用，主要包括細胞毒性，免疫毒性，遺傳毒性，以及

3、致畸性和致癌性等。近年來在體內(nèi)和體外模型上，DON被發(fā)現(xiàn)具有影響不同動物和細胞繁殖和胚胎發(fā)育的特征，豬和鼠是應(yīng)用廣泛的體內(nèi)實驗研究對象，而BeWo細胞和卵母細胞則是重要的體外實驗研究對象。雖然DON的胚胎發(fā)育毒性已被眾多研究所證實，但是其毒性作用機制仍需更深入的探討，而這一點將是本研究的重點之一。
　　早期的實驗已證實細胞內(nèi)ROS過度堆積所引起的氧化應(yīng)激是DON引起早期毒作用的重要機制之一。本研究將關(guān)注該毒作用機制是否存在于DON

4、誘導(dǎo)胎盤氧化損傷的模型中。胎盤（placenta）是母體與胎兒進行物質(zhì)交換的器官，胎兒在子宮中僅能依靠胎盤從母體獲得營養(yǎng)。HO-1是血紅素代謝的關(guān)鍵酶，其表達上調(diào)對于細胞來說是自我保護的適應(yīng)性機制之一，即一定程度上保護細胞免于各種因素引起的氧化損傷。就本實驗來說，一方面HO-1廣泛分布于全身（包括子宮和胎盤）組織細胞的微粒體內(nèi)，能被多種刺激因素（如低氧狀態(tài)、內(nèi)毒素及紫外線照射等）引起的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)表達，這是機體抵抗氧化損傷的重要機制之一

5、。另一方面HO-1的缺陷將導(dǎo)致多種妊娠不良結(jié)局的出現(xiàn)（如復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、死胎和先兆子癇等）。因此，我們認(rèn)為HO-1可作為本研究的效應(yīng)標(biāo)志物，同時探討其相關(guān)信號通路，即Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在該過程中的表達情況也是本研究的關(guān)注點之一。
　　綜上所述，本課題一方面可確證DON所致胚胎發(fā)育毒性，另一方面將深入分析DON引起胚胎發(fā)育毒性的分子機制。因此，該課題的完成將對DON發(fā)育毒性的早期預(yù)警和風(fēng)險評估基礎(chǔ)資料的建立起

6、到不可或缺的作用。
　　第一部分妊娠期脫氧雪腐鐮刀菌烯醇暴露對C57BL/6小鼠胚胎毒性研究
　　目的：對妊娠期DON染毒C57BL/6小鼠在妊娠末期進行胚胎發(fā)育評價，確證DON具有胚胎毒性，同時初步分析DON致胚胎毒性的特點。
　　方法：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后以2:1的比例將雌雄小鼠合籠，次日以查見陰栓者（查出精子）定為妊娠0.5 d（Gestation day0.5 d，GD0.5 d）。按體重將懷孕母鼠隨機分為4組

7、后在母鼠GD9.5-11.5 d分別給予不同劑量DON溶液連續(xù)灌胃染毒。具體分組情況如下：（1）陰性對照組（Control）：超純水；（2）DON低劑量組（DON-L）：1.0 mg/kg/day；（3）DON中劑量組（DON-M）：2.5 mg/kg/day；（4）DON高劑量組（DON-H）：5.0 mg/kg/day。GD18.5 d將母鼠頸椎脫臼處死，分離子宮觀察胎盤和胚胎。觀察外形的同時進行骨骼和內(nèi)臟的染色以確定是否存在相應(yīng)畸

8、形，同時計算與胚胎發(fā)育相關(guān)各指標(biāo)的數(shù)值并進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：（1）妊娠期DON暴露對母鼠的影響：DON對妊娠期母鼠引起的拒食和體重減輕等作用不明顯。各組母鼠的胎窩總重，胎盤總重和平均胎盤重未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）；
　　（2）妊娠期DON暴露對胚胎的影響：高劑量組的活胎率和吸收胎率與對照組相比具有顯著性差異（P<0.01），且高劑量組多只母鼠均出現(xiàn)全吸收胎的情況。DON對小鼠胚胎發(fā)育的影響可能并不表現(xiàn)在外觀和內(nèi)

9、臟畸形方面，而是表現(xiàn)在骨骼畸形方面，且全身各處骨骼均可檢出明顯的畸形。
　　結(jié)論：（1）初步證實DON具有胚胎毒性，且GD9.5-11.5 d時5.0 mg/kg DON暴露主要導(dǎo)致吸收胎，而2.5 mg/kg DON暴露對胚胎的影響則主要表現(xiàn)為骨骼畸形，另外1.0 mg/kg DON對母鼠和胚胎的影響未被觀察到；
　　（2）DON暴露引起的骨骼畸形分布于全身，如頭頸部，中軸骨，鎖骨和四肢骨骼均可檢出明顯的畸形，而其中尾部畸

10、形（卷尾）的發(fā)生率最高。
　　第二部分妊娠期脫氧雪腐鐮刀菌烯醇暴露對C57BL/6小鼠胎盤氧化應(yīng)激的影響
　　目的：觀察妊娠期DON暴露時胎盤氧化應(yīng)激水平和Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達水平。探討DON誘導(dǎo)胎盤氧化應(yīng)激在DON所致胚胎毒性中的角色，同時初步探討HO-1在此過程中所起作用。
　　方法：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后以2:1的比例將雌雄小鼠合籠，次日以查見陰栓者（查出精子）定為GD0.5 d。按體重將懷孕母鼠隨機

11、分為4組后在母鼠GD9.5-11.5 d分別給予不同劑量DON溶液連續(xù)灌胃染毒。具體分組情況如下：（1）陰性對照組（Control）：超純水；（2）DON低劑量組（DON-L）：1.0 mg/kg/day；（3）DON中劑量組（DON-M）：2.5 mg/kg/day；（4）DON高劑量組（DON-H）：5.0 mg/kg/day。GD18.5 d將母鼠頸椎脫臼處死后進行后續(xù)實驗。將胎盤組織固定并進行H&E染色，檢測胎盤組織ROS水平的

12、同時對氧化和抗氧化指標(biāo)（MDA，SOD，GSH）水平進行分析。此外，PCR和WB檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Nrf2/HO-1相關(guān)基因mRNA和蛋白表達水平的同時使用ELISA的方法測定胎盤組織中HO-1的酶水平。另外，采用激光共聚焦法來測定細胞中Nrf2的轉(zhuǎn)位。最后，初步探討炎癥和凋亡相關(guān)基因在此過程中的表達水平。
　　結(jié)果：（1）DON對胎盤的結(jié)構(gòu)和功能均具有損傷作用，在中劑量和高劑量組尤為明顯；
　?。?）妊娠期DON暴露會引起胎

13、盤ROS聚集，該現(xiàn)象在DON劑量為5.0 mg/kg/day時較為明顯。高劑量組MDA水平顯著高于對照組（P<0.01）。低、中劑量組與對照組相比SOD水平顯著性上升（P<0.05），且具有劑量效應(yīng)，而高劑量組未出現(xiàn)顯著性改變。然而，3個DON處理組與對照組相比GSH水平均無顯著性差異；
　　（3）3個DON處理組PIGF的mRNA表達水平均顯著性低于對照組（P<0.05），而以上3組的蛋白質(zhì)水平雖均低于對照組，但僅高劑量組與對照

14、組相比差異具有顯著性（P<0.01）；
　　（4）3個DON處理組HO-1酶水平均低于對照組，但從低劑量組到高劑量組表現(xiàn)出上調(diào)趨勢，其中低劑量組和中劑量組與對照組相比差異具有顯著性（P<0.05）；
　?。?）HO-1的mRNA在低劑量組顯著性高于對照組（P<0.05），而高劑量組顯著性低于對照組（P<0.01），而Nrf2的mRNA在低劑量組和中劑量組均顯著性高于對照組（P<0.05）。HO-1的蛋白表達在中劑量組（P<0

15、.01）和高劑量組（P<0.05）均顯著性高于對照組，而Nrf2的蛋白表達在低劑量組（P<0.05）、中劑量組（P<0.05）和高劑量組（P<0.01）均顯著性高于對照組。Keap-1的蛋白表達未出現(xiàn)顯著性改變。同時在該過程中胎盤中Nrf2由細胞質(zhì)向細胞核中轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象可被觀察到；
　?。?）炎癥相關(guān)指標(biāo)IL-6，IL-8，TNF-α和Cox-2的mRNA表達在3個DON處理組表現(xiàn)得頗為復(fù)雜，具體情況為低劑量組中發(fā)現(xiàn)TNF-α表達顯

16、著性上調(diào)（P<0.05），中劑量組Cox-2表達顯著性下調(diào)（P<0.05），而高劑量組則是IL-6顯著性下調(diào)（P<0.05）而IL-8顯著性上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：（1）妊娠期母鼠DON暴露將對母鼠胎盤產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能上的雙重?fù)p傷；
　?。?）胎盤結(jié)構(gòu)和功能的損傷可能與DON引起的胎盤氧化應(yīng)激相關(guān)，炎癥和凋亡也在該過程中出現(xiàn)，但其具體變化情況仍需進一步研究；
　?。?）胎盤中Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在DO

17、N發(fā)揮胚胎毒性過程中發(fā)生表達改變，并可能起到保護胎盤和胚胎發(fā)育的作用。
　　第三部分脫氧雪腐鐮刀菌烯醇染毒對BeWo細胞毒性分子機制研究
　　目的：對BeWo細胞給予不同劑量的DON染毒，同時結(jié)合HO-1激活劑（Hemin）和抑制劑（Znpp），探討DON染毒導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)對該細胞的影響。另外，驗證HO-1在DON染毒時在BeWo細胞中表達的時間-和劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　方法：復(fù)蘇細胞后在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每日觀察

18、細胞的生長和貼壁狀況，當(dāng)細胞融合程度達到80％時即可進行細胞傳代。而后按實驗要求將細胞接種到所需器皿上（如12孔板，96孔板或培養(yǎng)皿等），接種后保持隔天換液。使用CCK-8試劑盒進行細胞活力檢測，確定具體的分組：（1）陰性對照組：0 nM DON；（2）DON處理組：50 nM DON；（3）HO-1激活劑組：50 nM DON+10μM Hemin；（4）HO-1抑制劑組：50 nM DON+10μM Znpp。按以上分組培養(yǎng)1 h（

19、僅PCR），3 h，12 h和24 h后進行后續(xù)實驗。使用ELISA試劑盒分別測定細胞分泌β-HCG的水平和HO-1的酶水平。多功能酶標(biāo)儀被用來測定細胞內(nèi)ROS水平，此外運用不同的試劑盒測定細胞中MDA, SOD和GSH水平。PCR檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Nrf2/HO-1相關(guān)基因mRNA的表達水平。另外，采用激光共聚焦法來測定細胞中Nrf2的轉(zhuǎn)位。最后，PCR初步分析炎癥和凋亡相關(guān)基因mRNA在此過程中的表達水平。
　　結(jié)果：（1）所有

20、DON處理組β-HCG水平均顯著性低于對照組（P<0.01），在3 h和12 h時HO-1激活劑和抑制劑組與50 nM DON處理組相比均無顯著性差異，而在24 h時以上兩組β-HCG水平均顯著性低于50 nM DON處理組（P<0.05）；
　　（2）DON處理時細胞發(fā)生顯著的ROS堆積（P<0.01），而HO-1激活劑能顯著性改善DON處理引起的ROS堆積（P<0.01）。3 h時HO-1激活劑和抑制劑組MDA水平均顯著性高于

21、DON處理組（P<0.01），但在12 h時HO-1激活劑組變?yōu)轱@著性低于DON處理組（P<0.05）。Hemin在3 h表現(xiàn)為升高SOD水平（P<0.05），但此后均顯著性下調(diào)SOD水平（P<0.01），而Znpp僅在12 h表現(xiàn)為顯著性上調(diào)其水平（P<0.01）。Hemin在3 h顯著性下調(diào)GSH水平（P<0.01），而Znpp則在24 h顯著性上調(diào)GSH水平（P<0.01）；
　?。?）3 h時Hemin和Znpp分別表現(xiàn)出

22、相應(yīng)的上調(diào)和下調(diào)HO-1酶水平的作用（P<0.01），12 h時3個DON處理組無顯著性差異，24 h時Hemin和Znpp均表現(xiàn)為上調(diào)HO-1水平（P<0.01）；
　?。?）Hemin和Znpp在各時間點均升高HO-1的mRNA表達水平（P<0.01），Hemin僅上調(diào)3 h時Nrf2的表達（P<0.05），而Znpp上調(diào)12 h和24 h時Nrf2的mRNA表達（P<0.01）。此外，Hemin和Znpp預(yù)處理的BeWo細胞

23、在較長時間DON處理（如12 h和24 h）時，Nrf2將出現(xiàn)明顯的從細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)位的過程；
　?。?）隨著DON處理時間和劑量的增加，細胞炎癥反應(yīng)不斷增強，各炎癥因子表達趨勢較為復(fù)雜。
　　結(jié)論：（1）早期DON處理時，HO-1激活劑改善DON導(dǎo)致的細胞功能障礙，而隨著時間的進展，HO-1激活劑的該功能逐漸失效，反而是HO-1抑制劑起到更有效的改善功效；
　?。?）ROS水平對DON染毒時的胎盤滋養(yǎng)層細胞中HO-