中國(guó)對(duì)蝦蛋白R(shí)ab7與WSSV囊膜蛋白VP28的共定位及其作用區(qū)域解析.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是引起養(yǎng)殖對(duì)蝦大規(guī)模死亡的主要病毒性病原之一,目前在分子或基因水平上研究其流行病學(xué)、理化特性、基因、蛋白特性等已取得了一些突破性的進(jìn)展。隨著全基因組序列的公布,研究學(xué)者對(duì)WSSV功能基因的研究主要集中在病毒囊膜蛋白的研究,目前已經(jīng)確定的囊膜蛋白有VP28，VP26，VPl9,VP466和VP37等20多種。囊膜蛋白可以同宿主細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合并介導(dǎo)病毒

2、包膜和宿主細(xì)胞膜的融合,從而啟動(dòng)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PmRab7、β-integrin、Hsc70、BP53、PmCBP和STAT等宿主蛋白可以和WSSV囊膜蛋白結(jié)合。PmRab7是斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)的一種小GTP結(jié)合蛋白,有研究表明該蛋白與WSSV囊膜蛋白VP28特異性結(jié)合,并且其重組蛋白或抗體都可以降低WSSV感染對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的死亡率;另有RNA干擾結(jié)果表明,注射dsRNA-PmRab7沉默pmrab7基因的表達(dá)能夠抑制WSSV和黃頭

3、病毒(yellow head virus,YHV)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的感染,推測(cè)PmRab7可能參與了病毒復(fù)制過程中的內(nèi)吞運(yùn)輸。綜上所述,Rab7在對(duì)蝦防御WSSV中所起的作用不容忽視,但該蛋白是否分布在細(xì)胞膜上以受體身份參與WSSV感染,還是分布在細(xì)胞內(nèi)以結(jié)合因子身份參與感染目前尚未知。本論文通過研究中國(guó)對(duì)蝦體內(nèi)的Rab7與VP28的定位關(guān)系,解析二者相互作用的功能區(qū)域,為進(jìn)一步闡明Rab7在WSSV發(fā)生與發(fā)展過程中的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

4、
　　本研究主要包括4部分:利用cDNA末端擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)Rab7基因(pcrab7)全長(zhǎng)cDNA;通過構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pBAD/gIIIA-pcrab7,誘導(dǎo)表達(dá)和純化PcRab7蛋白,并制備PcRab7多克隆抗體;利用免疫印跡結(jié)合法(Western Blot)、Dynabeads磁珠免疫結(jié)合法和熒光免疫分析(FIA)檢測(cè)VP28和PcRab7的作用及二者

5、的具體結(jié)合位點(diǎn);利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色通過激光共聚焦顯微鏡分析Rab7在中國(guó)對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞中的定位以及與VP28的關(guān)系。
　　1、中國(guó)對(duì)蝦Rab7基因(pcrab7)全長(zhǎng)cDNA克隆:利用RACE方法成功克隆了中國(guó)對(duì)蝦pcrab7全長(zhǎng)cDNA(GenBank:JF742050),并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。pcrab7全長(zhǎng)1369bp,含有1個(gè)615bp開放閱讀框,編碼205個(gè)氨基酸,編碼產(chǎn)物的估算分子量23.2KD。通過對(duì)

6、pcrab7編碼蛋白的序列分析顯示,該基因產(chǎn)物具有許多Rab蛋白家族成員的共同特征,其氨基酸序列與凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的PcRab7蛋白的同源性為100％,其基因序列與凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的pcrab7基因的同源性分別為96%和97%。
　　2、PcRab7蛋白表達(dá)及多克隆抗體制備:構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA-pcrab7,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli內(nèi),用L-阿拉伯糖在37℃誘導(dǎo)重組基因工程菌,經(jīng)SDS-PAGE和對(duì)表

7、達(dá)序列標(biāo)簽(6×His)的檢測(cè),鑒定得到重組的目的蛋白,并利用純化的重組蛋白制備了兔抗PcRab7多克隆抗體。
　　3、VP28與PcRab7的結(jié)合及作用區(qū)域的分析:通過Western Blot和Dynabeads磁珠免疫結(jié)合法驗(yàn)證了PcRab7能與VP28結(jié)合;并且通過構(gòu)建PcRab7的基因缺失片段,利用Western Blot和FIA進(jìn)一步分析了VP28和PcRab7的具體結(jié)合位點(diǎn),初步發(fā)現(xiàn)PcRab7的第41-79AA和第1

8、25-160AA這兩個(gè)片段與VP28有結(jié)合活性。
　　4、PcRab7與 VP28在中國(guó)對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞中的定位分析:利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)PcRab7在中國(guó)對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞中進(jìn)行了定位,結(jié)果表明PcRab7主要分布在細(xì)胞膜內(nèi),膜外幾乎沒有PcRab7的分布;通過PcRab7與VP28的共定位分析,發(fā)現(xiàn)PcRab7與VP28以均勻結(jié)合的方式分布在細(xì)胞膜內(nèi),僅少數(shù)點(diǎn)狀分布在細(xì)胞膜外;提前加入VP28可促使PcR