WSSV-VP90、VP39與WSSV及宿主蛋白的作用.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失的一種病毒,該病毒具有死亡率高,宿主范圍廣等特點(diǎn),深入研究WSSV的致病性,對(duì)于有效控制WSSV感染具有重要意義。
　　本研究主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　第一部分:rVP90片段(以下簡(jiǎn)稱VP90p)的原核表達(dá)及與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白和宿主細(xì)胞蛋白的作用。根據(jù)GenBank上WSSV vp90基因的序列,用Premi

2、er5.0軟件設(shè)計(jì)合成引物。以WSSV DNA為模板,PCR擴(kuò)增得到vp90含RGD模序758bp基因,將其重組至pBAD/gIIIA中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA-vp90p并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10中。重組菌株Top10-pBAD/gIIIA-vp90p經(jīng)鑒定正確后,L-阿拉伯糖在37℃誘導(dǎo)重組基因工程菌,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè),顯示有與預(yù)期35kDa大小相符合的目的蛋白,采用Co2+親和層

3、析的方法,獲得純化的目的蛋白。
　　采用Far-western blot方法分析地高辛標(biāo)記的rVP90p與WSSV的作用,得到作用蛋白條帶經(jīng)質(zhì)譜鑒定為VP26和VP28。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,將標(biāo)記的VP90p與體外原核表達(dá)的rVP26、rVP28C、rVP28N進(jìn)行作用,結(jié)果表明,VP90p與VP26和VP28有作用。為研究VP90p是否可粘附于對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞,將FITC標(biāo)記的VP90p與對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞作用,激光共聚焦觀察

4、,發(fā)現(xiàn)VP90p與血淋巴細(xì)胞有作用。
　　第二部分:rVP39與WSSV及對(duì)蝦鰓膜蛋白的作用。在已有rVP39重組表達(dá)的基礎(chǔ)上,采用Far-western blot方法分析地高辛標(biāo)記的rVP39與WSSV的作用,得到顯色條帶經(jīng)質(zhì)譜鑒定為VP26,體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明rVP39與VP26的作用。此外通過標(biāo)記的rVP39與凡納濱對(duì)蝦鰓膜蛋白的作用,篩選出與一個(gè)與rVP39具有作用的鰓膜蛋白,經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定該宿主蛋白為F0-ATP s

5、ynthase b鏈的部分序列。
　　第三部分:F0-ATP synthase b鏈(簡(jiǎn)稱F0)的表達(dá)以及功能驗(yàn)證。根據(jù)F0-ATP synthase b鏈的部分序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增得到230 bp基因,構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA-F0并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10中。重組菌株經(jīng)鑒定正確后,L-阿拉伯糖誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè),顯示有與預(yù)期大小14kDa相符合的目的蛋白,采用Co2+親和層

6、析的方法,獲得純化的目的蛋白,制備兔抗。
　　Far-western blot實(shí)驗(yàn)表明,F0與rVP26、rVP28C、rVP28N、rVP39有作用,間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,VP26、VP28、VP39與F0共定位于感染對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞上。重組F0對(duì)WSSV感染的相對(duì)保護(hù)率為17.94％。組織分布實(shí)驗(yàn)分析表明,F0廣泛分布于對(duì)蝦肌肉、肝胰腺、腸、血淋巴、類淋巴、鰓組織中。細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明,F0分布于血淋巴細(xì)胞質(zhì)膜。Real-time