對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)膜蛋白VP52B的鑒定和功能研究及極早期基因啟動(dòng)子的篩選.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）是危害養(yǎng)殖對(duì)蝦的主要病原，致病能力強(qiáng)，傳播范圍廣，給世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，至今依然沒(méi)有有效的防治方法。本文圍繞病毒膜蛋白開展研究，此外，還對(duì)病毒的極早期基因啟動(dòng)子進(jìn)行了初步的篩選鑒定。研究工作主要包括以下幾個(gè)方面： （1）本文對(duì)WSSV膜蛋白VP52B進(jìn)行了鑒定和功能分析。該蛋白是病毒基因wsv256的編碼產(chǎn)物。在Ecoli BL—21菌株中表達(dá)了GST—VP52B，并制備了相應(yīng)的抗血清。

2、GST pull—down分析發(fā)現(xiàn)VP52B能與另一個(gè)病毒膜蛋白VP26相互作用。之前的研究認(rèn)為VP26是重要的連接蛋白，為了確定該蛋白與VP52B的結(jié)合位點(diǎn)，表達(dá)了不同長(zhǎng)度的VP26突變體，并發(fā)現(xiàn)VP26和VP52B相互作用的位點(diǎn)位于VP26135～170Aa。 （2）通過(guò)超聲法將WSSV基因組隨機(jī)斷裂至400～900bp DNA片段，并插入PIZ△IE/V5—EGFP載體以構(gòu)建文庫(kù)，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞H15后，發(fā)現(xiàn)其中部分細(xì)胞有增

3、強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的表達(dá)，說(shuō)明這部分細(xì)胞中的DNA片段可能具有極早期啟動(dòng)子活性。這對(duì)于進(jìn)一步篩選和鑒定WSSV極早期基因及開展極早期啟動(dòng)子研究具有重要意義。 （3）從WSSV基因組中選擇了20多個(gè)有鋅指結(jié)構(gòu)域或其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)結(jié)構(gòu)域的基因，克隆其上游400～500bp的啟動(dòng)子序列，連接到檢測(cè)啟動(dòng)子活性的載體中。轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞H15發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)ORF（ORF249、ORF403）上游序列具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。這兩個(gè)ORF序列