中國(guó)對(duì)蝦白斑癥病毒(WSSV)血細(xì)胞受體蛋白的研究.pdf

1、白斑癥病毒(WSSV)病是危害我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一，目前仍無切實(shí)有效的防控措施。病毒細(xì)胞受體是介導(dǎo)病毒的侵入門戶，因此WSSV細(xì)胞受體的尋找及鑒定是弄清病毒感染機(jī)理的關(guān)鍵點(diǎn)之一，也是實(shí)現(xiàn)白斑病防控的重要理論基礎(chǔ)。目前研究表明WSSV的多個(gè)囊膜蛋白含有RGD(Arg-Gly-AsP)模體，且其中多個(gè)囊膜蛋白的抗體被證實(shí)具有病毒中和活性，說明其與WSSV感染密切相關(guān)，由于細(xì)胞膜受體蛋白整合素能保守地與RGD模體結(jié)合，所以其可

2、能為WSSV潛在受體蛋白。本論文克隆了中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞β-integrin基因cDNA全序列，序列特性分析顯示其含有整合素β亞基所有的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析該基因在不同組織內(nèi)和WSSV感染后的差異表達(dá)情況，顯示其與WSSV感染密切相關(guān)。在序列分析的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行分段表達(dá)，分別構(gòu)建β-integrin胞外區(qū)和VWA結(jié)構(gòu)域重組表達(dá)載體，特性研究顯示β-integrin重組蛋白具有的WSSV體外結(jié)合活性和體內(nèi)中和活性，證實(shí)了β-integ

3、rin為WSSV一個(gè)重要的細(xì)胞膜受體蛋白。制備了抗β-integrin單克隆抗體，利用其分析β-integrin的組織分布特性，結(jié)果顯示在WSSV易感組織器官內(nèi)β-integrin蛋白豐度顯著高于其他組織，揭示W(wǎng)SSV組織親嗜性的分子基礎(chǔ)；同時(shí)，大量制備抗中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞膜單克隆抗體，建立受體單抗體外篩選模型，篩選到兩株具明顯阻斷效果的受體單抗，并對(duì)相應(yīng)的受體蛋白進(jìn)行鑒定和功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示中國(guó)對(duì)蝦血藍(lán)蛋白和血細(xì)胞beta-actin能與

4、WSSV發(fā)生結(jié)合，這種結(jié)合可以被篩選到的單抗3C4和2F9所抑制，說明建立的WSSV受體單抗篩選體系可以應(yīng)用于WSSV受體研究。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞整合素β亞基編碼基因的中間保守序列，通過RACE技術(shù)獲得整合素β亞基cDNA序列，序列全長(zhǎng)2853 bp，含一個(gè)2349 bp的開放閱讀框，編碼783氨基酸。同源比對(duì)分析顯示該基因與整合素β1型亞基相似性最高。同時(shí)，利用半定量RT-PC

5、R分析了β-integrin基因在中國(guó)對(duì)蝦不同組織內(nèi)及其WSSV感染后鰓組織中的轉(zhuǎn)錄差異情況，結(jié)果顯示該基因在血細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平最高，心臟和鰓組織次之，在腸道和性腺中也有較高的轉(zhuǎn)錄水平，在肌肉和肝胰腺中轉(zhuǎn)錄水平最低。中國(guó)對(duì)蝦在感染W(wǎng)SSV后，鰓組織中β-integrin基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，在感染后24小時(shí)到達(dá)最高水平，然后呈下降趨勢(shì)。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)該基因轉(zhuǎn)錄較高的組織為WSSV感染的主要靶器官，且在WSSV感染后出現(xiàn)明顯上調(diào)，說明該基

6、因與WSSV感染密切相關(guān)。
　　 (2)構(gòu)建了β-integrin胞外區(qū)和VWA結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)載體pET32a-ER-βintegrin和pET32a-VWA-βintegrin，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后成功表達(dá)，分別獲得分子量大小為100和50 kDa的重組蛋白。ELISA和dot blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-integrin胞外區(qū)和VWA結(jié)構(gòu)域重組表達(dá)蛋白均具有WSSV結(jié)合活性。通過螯蝦體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-integrin胞外

7、區(qū)重組表達(dá)蛋白具有顯著的WSSV中和活性，以上結(jié)果說明中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞β-integrin為WSSV一個(gè)重要的細(xì)胞膜受體蛋白，在WSSV感染過程中發(fā)揮重要作用。
　　 (3)研制出5株特異性穩(wěn)定分泌抗中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞β-integrin的雜交瘤細(xì)胞2C5、2C10、1F4、1C10和1D10。間接免疫熒光結(jié)果顯示5株單抗均可與中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞膜結(jié)合，western blotting結(jié)果顯示，5株單抗均可以與β-integrinVWA結(jié)

8、構(gòu)域重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，同時(shí)能特異性識(shí)別1條分子量為120 kDa左右中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞蛋白，推測(cè)其為中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞β-integrin。以研制的抗中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞β-integrin單克隆抗體，檢測(cè)β-integrin在不同組織器官內(nèi)的分布特性，在心臟、鰓和腸道中可以觀察到明顯的綠色熒光信號(hào)，而在肌肉和肝胰腺組織中則沒有觀察到明顯的熒光陽性信號(hào)，說明WSSV細(xì)胞膜受體蛋白β-integrin在病毒易感組織心臟、鰓和腸道中的豐度顯著高于肌

9、肉和肝胰腺組織，這一結(jié)果為揭示W(wǎng)SSV組織親嗜性的分子基礎(chǔ)提供了重要支持。
　　 (4)大量制備抗中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞單克隆抗體，基于ELISA和dot blotting技術(shù)，以中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞膜和地高辛標(biāo)記的WSSV(WSSV-DIG)建立病毒受體單抗體外篩選模型，從制備的中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞膜單克隆抗體中篩選到具有阻斷效果的單抗3C4和2F9。Western blotting結(jié)果顯示，篩選到的單抗3C4與中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞1條分子量為42 k