WSSV-VP28融合蛋白的免疫效果及F0-ATP合酶cDNA的克隆.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）是對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生巨大危害的病毒，目前還未發(fā)現(xiàn)有效的治療措施。為了尋找對(duì)該病毒的有效防控方法，本文構(gòu)建了三種含VP28的融合蛋白并研究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦的保護(hù)作用，在最后一節(jié)內(nèi)容中，克隆了與WSSV感染過(guò)程相關(guān)的F0-ATP合酶序列的全長(zhǎng)，以上研究為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供基礎(chǔ)。
　　1.針對(duì)VP28C和Hsp70p這兩段目的基因，設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增分別得到了目的基因，經(jīng)雙酶切和連接反應(yīng)，成功的將這兩個(gè)片

2、段克隆至載體pBAD/gⅢA中。通過(guò)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將構(gòu)建的重組載體導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞Top10中。將大腸桿菌進(jìn)行大量的培養(yǎng)后，添加一定濃度的誘導(dǎo)劑，使構(gòu)建的融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)得到了成功的表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western-blot對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)Co2+親和層析和超濾技術(shù)獲得純化的目的蛋白獲得了濃度較高的純化蛋白。通過(guò)肌肉注射的方式將蛋白注射到對(duì)蝦體內(nèi)，采用病料投喂方式進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦感染，結(jié)果表明，構(gòu)建的融合蛋白對(duì)對(duì)蝦有

3、一定的保護(hù)作用。通過(guò)熒光定量實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了對(duì)蝦體內(nèi)與免疫反應(yīng)相關(guān)的幾種基因的表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射蛋白的對(duì)蝦組與對(duì)照組相比，其免疫相關(guān)的基因SOD、LZM、CAT和STAT的表達(dá)量有不同程度的增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了該蛋白對(duì)對(duì)蝦的保護(hù)作用。
　　2.針對(duì)凡納濱對(duì)蝦鐵蛋白基因序列，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增得到了凡納濱對(duì)蝦的鐵蛋白基因，經(jīng)過(guò)雙酶切和連接反應(yīng)，將鐵蛋白基因和VP28C基因這兩段目的基因成功克隆至pBAD/gⅢ

4、A中。通過(guò)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將構(gòu)建好的重組載體成功導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌中。測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建的重組載體序列完全正確。在將大腸桿菌進(jìn)行大量培養(yǎng)后，通過(guò)加入一定濃度的誘導(dǎo)劑L-Arab，使構(gòu)建的重組載體在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行了成功的表達(dá)。通過(guò)Co2+親和層析和超濾技術(shù)，獲得了純度較高的目的蛋白。利用SDS-PAGE和Western-blot對(duì)純化獲得的蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)肌肉注射的方式將該蛋白注射到對(duì)蝦的體內(nèi)，在免疫期過(guò)后通過(guò)給對(duì)蝦投喂病

5、料的方式讓對(duì)蝦感染 WSSV以研究該蛋白對(duì)對(duì)蝦的保護(hù)作用。統(tǒng)計(jì)的累計(jì)死亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比該蛋白對(duì)對(duì)蝦有一定的保護(hù)作用并且在病毒感染的前期其保護(hù)效果更加明顯。通過(guò)熒光定量實(shí)驗(yàn)分析了對(duì)蝦體內(nèi)LGBP和LvP38基因的表達(dá)量的變化，結(jié)果表明，在注射該蛋白后對(duì)蝦體內(nèi)這兩種基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯的增加，這進(jìn)一步驗(yàn)證了該蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦對(duì)蝦的保護(hù)作用。
　　3.通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料，獲得了細(xì)胞穿透肽（TAT）的基因序列，通過(guò)在線

6、設(shè)計(jì)優(yōu)化軟件，對(duì)這段序列進(jìn)行了優(yōu)化和合成，使其更適于在大腸桿菌中表達(dá)。通過(guò)雙酶切和連接反應(yīng)，構(gòu)建TAT-VP28C重組載體。經(jīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將該載體導(dǎo)入到大腸桿菌，在將大腸桿菌進(jìn)行大量培養(yǎng)后，通過(guò)添加一定濃度的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，該蛋白得到了成功的表達(dá)。通過(guò)Co2+親和層析技術(shù)對(duì)該蛋白進(jìn)行了純化，但是在蛋白純化后的蛋白復(fù)性中，該蛋白出現(xiàn)了大量的析出，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,復(fù)性條件還需要進(jìn)一步的摸索。
　　4.根據(jù)已經(jīng)公布的F0-ATP合

7、酶的部分序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，采用 RACE方法克隆得到了凡納濱對(duì)蝦的F0-ATP合酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列。生物信息學(xué)分析顯示，該基因的開(kāi)放閱讀框744 bp，編碼248個(gè)氨基酸，分子量為28.2 kD。Blast結(jié)果顯示，克隆得到的cDNA序列所編碼的氨基酸序列與海虱(Caligus clemensi) F0-ATP合酶β亞基的同源性為50％,與黑腹果蠅(Drosophila melanogaster) F0-ATP合酶β亞基的同源性