整合WSSV囊膜蛋白VP37的假型HIV病毒的構(gòu)建與功能研究.pdf

1、對蝦白斑綜合征病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)自從90年代初以來給全球蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的危害，目前已成為海水養(yǎng)殖中主要的病原之一，引起越來越多的關注。自WSSV基因組全序列公布以來，各國對于對蝦白斑綜合征(Whitespotsyndrome，WSS)的研究焦點現(xiàn)已逐漸集中到蛋白質(zhì)組學方向，研究該病毒基因產(chǎn)物的功能，弄清病毒各蛋白在病毒粒子上的定位以及在病毒感染宿主細胞的過程中所起的作用，借此希望能夠找到有

2、效的預防和治療對蝦白斑綜合征的方法途徑和技術(shù)手段。由于假型病毒(pseudotypedvirus)的細胞嗜性和感染過程和真病毒相似，可以模擬病毒早期的感染過程，而且攜帶報告基因的假型病毒可以方便快速的進行各種分析和檢測，因此假型病毒不僅能夠更好的研究病毒與宿主細胞之間的相互關系，鑒定病毒受體，還可以用于篩選抗病毒藥物、評價中和抗體效價、評價疫苗免疫的效果等。所以本論文選擇了攜帶有綠色熒光蛋白EGFP報告基因的真核表達載體pEGFP-N1

3、與WSSV的一種囊膜蛋白VP37融合表達，并采用HIV假型病毒構(gòu)建系統(tǒng)將綠色熒光蛋白EGFP和蛋白VP37整合在假型病毒的外膜蛋白上，構(gòu)建出整合WSSV襲膜蛋白VP37的假型HIV病毒，并對其進行驗證和功能分析。
　　 本研究主要包括3部分內(nèi)容:用慢病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建整合WSSV囊膜蛋白VP37的假型HIV病毒;對構(gòu)建出的整合WSSV囊膜蛋白VP37的假型HIV病毒進行電鏡和分子生物學檢測;用整合WSSV囊膜蛋白VP37的假型HI

4、V病毒對WSSV粒子侵染蝦細胞進行中和保護實驗。
　　 本論文取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)GenBank中WSSV的vp37基因序列(NO.EF661845.1)，使用PrimerPremier5.0生物軟件設計了一對引物，并利用聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction，PCR)從由本實驗室分離保存的WSSV粒子中擴增出目的基因片段，經(jīng)測序鑒定后，將目的片段與真核表達載體pEGFP-N1

5、進行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，經(jīng)菌落PCR鑒定的陽性單克隆進行了擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對其進行了雙酶切鑒定，然后測序鑒定了雙酶切產(chǎn)物，成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pEGFP-N1-vp37。
　　 2.重組表達質(zhì)粒pEGFP-N1-vp37與質(zhì)粒PNL4-3共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T，轉(zhuǎn)染48h后，分別收集細胞和培養(yǎng)液，經(jīng)處理反復凍融等處理后假病毒液保存到-80℃。取部分假病毒進行電鏡和熒光顯微鏡觀察、SDS-PAGE和Wes

6、tern-blot檢測，證實了整合WSSV囊膜蛋白VP37的假型HIV病毒的成功構(gòu)建。
　　 3.用改良2×L15培養(yǎng)液對日本囊對蝦(Penaeusjaponicus)的血淋巴細胞進行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)24h時用假病毒液處理蝦細胞，繼續(xù)培養(yǎng)30min后再用WSSV粒子處理，然后繼續(xù)培養(yǎng)24h，DAPI染色后熒光顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和活細胞的數(shù)量，確定了整合WSSV囊膜蛋白VP37的假型HIV病毒可以和日本囊對蝦血淋巴細胞結(jié)合，并能抑