靶向HIV和AIV包膜蛋白跨膜亞基的病毒進(jìn)入抑制劑研究.pdf

1、艾滋病和禽流感成為當(dāng)今中國乃至全世界有深遠(yuǎn)影響的重大流行疾病，是當(dāng)前人類健康面臨的重大威脅，但一直以來缺乏有效的治療藥物和疫苗。與SARS冠狀病毒（SARS-CoV）相似，人類免疫缺陷病毒（HIV）和禽流感病毒（AIV）均為Ⅰ型包膜病毒，采用相似的病毒-宿主細(xì)胞膜融合機(jī)制，即病毒表面糖蛋白結(jié)合到宿主細(xì)胞受體后，啟動病毒融合蛋白的一系列構(gòu)象變化。包膜病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的過程需要病毒膜糖蛋白的介導(dǎo)，這一類型病毒的包膜蛋白一般都具有兩個亞基，其中

2、不跨膜的亞基（如HIV的gp120、AIV的HA1等）具有與靶細(xì)胞膜上病毒受體相結(jié)合的位點，而跨膜亞基（如HIV的gp41、AIV的HA2等）則介導(dǎo)病毒膜與靶細(xì)胞膜的融合。以上述研究為基礎(chǔ)設(shè)計的病毒進(jìn)入抑制劑，可以在病毒包膜糖蛋白中間體構(gòu)象形成的短時間內(nèi)，高效、特異地競爭結(jié)合其配體，從而阻止包膜糖蛋白的進(jìn)一步折疊，達(dá)到抑制病毒入侵的目的，為病毒疾病的防治提供了新思路和策略。 HIV是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒，主要感染CD

3、4+T淋巴細(xì)胞，特征性的引起CD4+T細(xì)胞逐步減少和進(jìn)行性免疫缺陷，最后導(dǎo)致艾滋病（獲得性免疫缺陷綜合征），引起機(jī)會性感染并最終導(dǎo)致死亡。病毒與宿主免疫細(xì)胞的相互作用是影響疾病發(fā)展的重要因素。在HIV感染導(dǎo)致的AIDS疾病進(jìn)展過程中，T細(xì)胞活化是一把雙刃劍。一方面CD4+T細(xì)胞的活化在清除病毒過程是非常必要的，成熟的CD4+Th細(xì)胞是抗病毒免疫的關(guān)鍵因素。另一方面，HIV膜蛋白（Env）能結(jié)合CD4+受體，在CD4+T細(xì)胞中復(fù)制，由于病

4、毒顆粒的持續(xù)表達(dá)，HIV感染導(dǎo)致T細(xì)胞增殖增加，T細(xì)胞活化后又可借助自身表達(dá)的凋亡受體與配體的結(jié)合，使已發(fā)生特異性克隆擴(kuò)增的T細(xì)胞發(fā)生自身凋亡而數(shù)量下降。因此，適度的T細(xì)胞活化可能作為HIV治療的一種方法和策略。 為此，本課題根據(jù)在HIV和SARS病毒進(jìn)入抑制劑研究領(lǐng)域積累的經(jīng)驗，以AIV和HIV作為研究對象，為研究AIV病毒進(jìn)入抑制劑和HIV殺微生物劑奠定研究基礎(chǔ)。 （1）靶向H5N1禽流感病毒血凝素亞基HA2的病毒進(jìn)

5、入抑制劑研究：建立抑制H5N1型AIV六螺旋束結(jié)構(gòu)和N-端帽子結(jié)構(gòu)形成的高通量篩選模型，并建立H5N1型禽流感假病毒模型，篩選小分子化合物庫，再利用活病毒感染MDCK模型和活病毒感染小鼠模型，驗證篩選出的小分子化合物的抗病毒活性，尋找能有效抑制H5N1型AIV進(jìn)入靶細(xì)胞，且具有良好膜通透性的活性分子，為開發(fā)抗禽流感病毒進(jìn)入抑制劑類藥物奠定基礎(chǔ)。 （2）抗HIV多肽VIR576對抗原特異性T細(xì)胞活化的影響：采用T細(xì)胞活化的檢測方法

6、，研究VIR576對抗原特異性T細(xì)胞活化的影響和作用機(jī)制。由于HIV感染與T細(xì)胞關(guān)系密切，研究將有助于初步探討VIR576與T細(xì)胞的關(guān)系，并分析其對HIV病毒感染的可能影響，有助于評價VIR576作為抗HIV殺微生物劑的可能性和機(jī)制。 第一部分、靶向H5N1禽流感病毒血凝素亞基HA2的病毒進(jìn)入抑制劑研究。 目的： 建立抑制H5N1型AVI六螺旋束結(jié)構(gòu)和N-端帽子結(jié)構(gòu)形成的高通量篩選方法，并建立H5N1型禽流感假病

7、毒模型，篩選小分子化合物庫，得到小分子抗AIV化合物，再利用H5N1型活病毒感染MDCK模型和H5N1型活病毒感染小鼠模型進(jìn)行驗證，尋找能有效抑制H5N1型AIV感染的活性分子，研究其抗禽流感的作用。 方法： 1.合成衍生于H5N1高致病性禽流感病毒血凝素亞基HA2的多肽，包括N-多肽（N29，aa77～aa105）、C-多肽（C19，aa110～aa128）以及用FITC標(biāo)記的熒光C-多肽、生物素標(biāo)記的N-末端帽子多肽

8、（N8，aa34～aa37）、FITC標(biāo)記的C-末端帽子多肽（C8，aa173～aa176）。通過FLISA、熒光天然凝膠電泳、分子篩高效液相色譜等方法研究兩組多肽間的相互作用，嘗試建立阻止六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的熒光高通量篩選方法、抑制N-端帽子形成的高通量篩選方法、阻止六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的熒光天然凝膠電泳和分子篩高效液相色譜。 2.建立細(xì)胞水平的H5N1型禽流感假病毒活性檢測方法：禽流感病毒（Avian influenza viru

9、s，AIV）的包膜蛋白有兩個，分別為血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA），將表達(dá)這兩個包膜蛋白的質(zhì)粒與pNL43-Luc.R-E-（帶有熒光素酶報告基因的HIV-1基因）共轉(zhuǎn)染至293 T細(xì)胞后，細(xì)胞表達(dá)禽流感病毒包膜蛋白（HA、NA）和HIV-1顆粒，它們可被組裝成為HA-NA/HIV假病毒，用來篩選作用于禽流感病毒包膜蛋白的化合物。 3.抗流感藥物活性驗證：應(yīng)用H5N1型

10、活病毒感染MDCK細(xì)胞模型和H5N1型活病毒感染Balb/c鼠模型進(jìn)行活性驗證，檢測藥物對病毒感染的MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用及對MDCK細(xì)胞的毒性（CPE觀察及XTT法檢測）、藥物對病毒感染動物的死亡保護(hù)作用等，評價抗流感病毒新藥。即XTT法檢測藥物對MDCK細(xì)胞的毒性，CPE法（細(xì)胞病變）檢測藥物對流感病毒感染的MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用，流感病毒對小鼠半數(shù)致死量（LD50）的測定和藥物對流感病毒感染小鼠的死亡保護(hù)試驗。 4.建立小

11、鼠血漿中ARC-36的HPLC檢測方法，研究ARC-36在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)，考察小鼠腹腔注射ARC-36的急性毒性。 結(jié)論： 1.人工合成的衍生于H5N1高致病性禽流感病毒血凝素亞基HA2的多肽沒有抑制H5N1禽流感的活性。采用FLISA、圓二色譜、熒光天然凝膠電泳、分子篩高效液相色譜等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，各組多肽之間沒有相互作用，無法建立抑制H5N1型AVI六螺旋束結(jié)構(gòu)和N-端帽子結(jié)構(gòu)形成的高通量篩選方法。 2.建立

12、的假病毒體系HA-NA/HIV可高效感染多種細(xì)胞系，篩選出的化合物ARC-36抑制H5N1禽流感假病毒活性較高，且作用于病毒進(jìn)入階段。 3.ARC-36對H5N1型禽流感病毒有較強(qiáng)的抑制作用，且ARC-36滴鼻或腹腔注射均可以延長小鼠的存活時間，但對小鼠存活率沒有明顯的保護(hù)作用，可能原因是ARC-36的半衰期較短。 4.本實驗建立的小鼠血漿中ARC-36的HPLC測定法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于ARC-36的體內(nèi)定量分

13、析。小鼠腹腔靜脈注射ARC-36后血漿C-t曲線呈二室模型，ARC-36在血中清除迅速。小鼠腹腔注射ARC-36具有一定的安全性。 第二部分、抗HIV多肽VIR576對抗原特異性T細(xì)胞活化的影響及機(jī)制研究。 目的： 采用T細(xì)胞活化的檢測方法，研究VIR576對抗原特異性T細(xì)胞活化的作用，探討其對T細(xì)胞活化及HIV免疫的影響；并用生物物理等方法研究VIR576與TCR-TMD之間的相互作用，評價VIR576作為HI

14、V殺微生物劑的可能性和機(jī)制。 方法： 1.MOG35-55體外刺激抗原特異性T細(xì)胞系A(chǔ)2b細(xì)胞，[3H]脫氧胸苷攝入法測定VIR576對A2b細(xì)胞活化的影響；OVA體外刺激分離的DO11.10小鼠抗原特異性T細(xì)胞，CCK-8法測定VIR576對其活化的影響；刀豆蛋白（ConA）或抗鼠CD3抗體體外刺激非抗原特異性小鼠T細(xì)胞，CCK-8法測定VIR576對其活化的影響；采用免疫磁珠兩步法分離小鼠脾組織CD4+CD25-T細(xì)

15、胞，CCK-8法測定VIR576對其活化的影響。 2.用溶血試驗、溶血抑制實驗、FRET、FLISA、競爭性FLISA等方法檢測VIR576與TCR-TMD之間的相互作用，并研究其主要的結(jié)合區(qū)域。多肽TCR-TMD加入到人紅細(xì)胞懸液，在405 nm處測吸光度，考察多肽TCR-TMD的插膜作用；多肽VIR576或VIR-scram與多肽TCR-TMD孵育后加入到人紅細(xì)胞懸液，考察其對多肽TCR-TMD插膜作用的抑制作用。TCR-T

16、MD包被到96孔酶標(biāo)板里，加入相應(yīng)濃度的Rho-VIR576，；或者加入Rho-VIR576和未標(biāo)記的VIR576，讀取各孔熒光密度值，考察TCR-TMD與VIR576之間的相互作用。用FRET技術(shù)考察TCR-TMD的核心序列CP與VIR576的相互關(guān)系，將CP-NBD加入到LUV溶液，在467 nm波長激發(fā)，500 nm-600 nm波長發(fā)射，再加入Rho-VIR576，考察其能量轉(zhuǎn)移（FRET）。 3.BALB/c小鼠脾細(xì)胞

17、用抗鼠-CD3抗體刺激72小時后，4%多聚甲醛冰上固定，加入1：50稀釋的兔抗鼠CD4抗體，再加入1：50稀釋的標(biāo)記的羊抗兔IgG，在孵育的最后5 min加入Rho-VIR576。細(xì)胞用PBS洗三次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察VIR576在T細(xì)胞細(xì)胞膜的定位和與TCR分子的共分布情況。 結(jié)論： 1.VIR576能抑制抗原特異性T細(xì)胞活化，也能反轉(zhuǎn)FP介導(dǎo)的抗原特異性T細(xì)胞活化，但對非抗原特異性T細(xì)胞活化沒有作用。