登革病毒包膜蛋白EDⅢ抗體中和活性與增強(qiáng)活性研究.pdf

1、登革熱(dengue)是全球蔓延最快的蟲媒傳播疾病，通過感染登革病毒(DENV)蚊子的叮咬在人群中傳播，全世界40％以上約25億人面臨罹患登革熱危險(xiǎn)。感染4種DENV（DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4）血清型的其中一種都會(huì)引起廣泛的臨床癥狀，DENV基因組是單股RNA鏈（大約11kb），包含單個(gè)開放讀碼框，編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。
　　在自然狀態(tài)下，DENV感染機(jī)體后，登革病毒的多種抗原成分均能夠誘

2、導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答，各種抗原成分在抗原競(jìng)爭(zhēng)中，形成了優(yōu)勢(shì)表位與非優(yōu)勢(shì)表位，但是后者在抗原競(jìng)爭(zhēng)中難以有效地刺激中和保護(hù)性。因此，我們探索非優(yōu)勢(shì)抗原表位是否能夠作為單一的免疫原，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈中和保護(hù)性且微弱或無增強(qiáng)感染的抗體。
　　本研究集中在以下三個(gè)方面:
　　一、DENV EDⅢ交叉反應(yīng)單抗識(shí)別表位的關(guān)鍵殘基的確定
　　本團(tuán)隊(duì)前期工作中分別使用四種DENV血清型重組EDⅢ蛋白免疫小鼠，制備了一組抗DENV-1

3、，-2，-3和-4 EDⅢ的單抗，篩選出對(duì)四種血清型DENV有交叉反應(yīng)性的單抗。對(duì)這些單抗進(jìn)行合成重疊多肽掃描分析中發(fā)現(xiàn)，大約2/3的交叉反應(yīng)性單抗特異性識(shí)別高度保守的EDⅢ aa310KEVAETQHGT319序列，并且鑒定了這些單抗與重組EDⅢ蛋白結(jié)合能力強(qiáng)但中和活性較為復(fù)雜，表現(xiàn)為對(duì)四種不同血清型DENV出現(xiàn)強(qiáng)烈、中等或無的中和活性。為了進(jìn)一步明確該氨基酸序列中抗原抗體結(jié)合的關(guān)鍵殘基，我們采用酵母表面展示技術(shù)將DENV EDⅢ蛋白

4、表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，并使用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)aa310-319的十個(gè)氨基酸進(jìn)行逐一突變，隨后將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，獲得十種EDⅢ單點(diǎn)突變蛋白。使用流式細(xì)胞分析EDⅢ交叉反應(yīng)單抗與十種突變體的結(jié)合情況。酵母表面展示技術(shù)是研究可溶性蛋白間相互作用的有效工具，其可以簡(jiǎn)單快速地用于確定抗原與抗體、受體與配基的結(jié)合及相互作用。酵母以其真核細(xì)胞翻譯后蛋白加工修飾的特點(diǎn)，使其表達(dá)產(chǎn)物更接近于天然構(gòu)象。體外定點(diǎn)突變則是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系常

5、規(guī)工具，能夠簡(jiǎn)便、快速且高效的獲得改造DNA序列或DNA表達(dá)的目的蛋白，從微觀水平上闡明正常狀態(tài)與突變狀態(tài)的差異性。酵母展示技術(shù)與定點(diǎn)突變技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用，簡(jiǎn)便高效的實(shí)現(xiàn)突變DNA序列在蛋白表現(xiàn)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EDⅢ氨基酸序列中的Q316和H317是交叉反應(yīng)EDⅢ單克隆抗體抗原抗體結(jié)合的關(guān)鍵殘基，為進(jìn)一步優(yōu)化修飾EDⅢ亞單位疫苗的策略奠定基礎(chǔ)。
　　二、建立高通量簡(jiǎn)便的方法評(píng)價(jià)DENV抗體的增強(qiáng)功能
　　DENV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生

6、的抗體反應(yīng)是一把雙刃劍，有保護(hù)性免疫，也可能加重病情。所以，DENV抗體的研究必須從保護(hù)性能和增強(qiáng)感染性能這兩方面著手。DENVE蛋白是主要的保護(hù)性抗原，也是中和抗體主要的靶向成份。當(dāng)具有中和活性的抗體分子與E蛋白抗原決定簇結(jié)合，阻止E蛋白與靶細(xì)胞結(jié)合或者阻止病毒RNA釋放進(jìn)入易感細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，即發(fā)揮保護(hù)作用。而當(dāng)亞中和或非中和抗體Fc段與細(xì)胞膜上Fcγ受體(FcγR)結(jié)合，增加了DENV和細(xì)胞黏附的機(jī)會(huì)，從而促使DENV進(jìn)入細(xì)胞，使

7、得細(xì)胞易感?；诟腥綝ENV后NS1蛋白分泌與登革熱疾病的嚴(yán)重程度是密切相關(guān)，本團(tuán)隊(duì)前期建立了測(cè)定抗體和血清中和活性的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微中和實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunospotmicroneutralization test，ELISPOT-MNT)方法，能夠方便、客觀地評(píng)價(jià)DENV抗體的中和活性。因此，為了更全面評(píng)價(jià)抗體或血清中和保護(hù)性和增強(qiáng)活性，我們建立并評(píng)估ADE技術(shù)是在前期建立的NS1抗原捕獲ELISA檢測(cè)DENV

8、NS1蛋白含量的基礎(chǔ)上，用表達(dá)FcγR的K562細(xì)胞株和已知公認(rèn)的具有增強(qiáng)活性的單抗4G2為陽性對(duì)照，建立了高通量簡(jiǎn)便的檢測(cè)登革抗體和血清的ADE檢測(cè)方法(ADE assay based quantitative measurement of NS1 antigen captureELISA，ELISA-ADE)。即使用傳統(tǒng)病毒滴度測(cè)定方法平行驗(yàn)證NS1抗原定量新ELISA-ADE方法檢測(cè)4G2增強(qiáng)感染時(shí)的NS1蛋白含量是否具有一致性，

9、經(jīng)過Spearman相關(guān)分析表明，兩種方法顯著相關(guān)。隨后，使用ELISPOT-MNT和ELISA-ADE方法檢測(cè)了4G2和6份DENV-1感染患者恢復(fù)期血清的中和活性和增強(qiáng)活性，發(fā)現(xiàn)4G2和患者血清的增強(qiáng)峰值均出現(xiàn)在亞中和濃度，符合公認(rèn)的中和與增強(qiáng)濃度關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證ELISA-ADE方法學(xué)的可靠性。并且分析了前期制備具有強(qiáng)烈中和活性的交叉反應(yīng)EDⅢ單克隆抗體2D73和3E31的中和活性與增強(qiáng)活性的關(guān)系。結(jié)果顯示，2D73的ADE增強(qiáng)感

10、染峰值同樣出現(xiàn)在亞中和濃度下，而3E31僅有微弱或無增強(qiáng)感染的效應(yīng)。提示3E31具有作為免疫治療性抗體的潛能。
　　三、DENV-1感染患者血清和兔抗EDⅢ血清的EDⅢ反應(yīng)抗體的功能研究
　　DENV EDⅢ是中和抗體的靶標(biāo)，是有潛力的登革疫苗的候選者。然而，近些年研究表明DENV感染人血清中的EDⅢ抗體僅占DENV總抗體的一小部分，其中和活性和增強(qiáng)活性作用微弱。但我們分析認(rèn)為:在DENV自然感染中，多種DENV抗原可誘導(dǎo)產(chǎn)

11、生多克隆多特異性抗體，有些誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)的表位未必是優(yōu)勢(shì)表位，因而在抗原競(jìng)爭(zhēng)中處于弱勢(shì)而不能產(chǎn)生足量的保護(hù)性抗體。針對(duì)這種情況可利用純化的亞單位疫苗來避免抗原競(jìng)爭(zhēng)而誘導(dǎo)有效的保護(hù)性反應(yīng)。國(guó)外多數(shù)DENV感染患者血清的EDⅢ抗體的研究集中在DENV-2和-3感染，而中國(guó)南方地區(qū)60％的DENV感染為DENV-1。本研究用重組DENV-1EDⅢ免疫新西蘭白兔制備抗EDⅢ多克隆免疫兔血清，全面分析了抗EDⅢ兔血清與DENV-1感染患者恢復(fù)期血

12、清中EDⅢ反應(yīng)抗體的中和保護(hù)作用與ADE效應(yīng)，探索EDⅢ作為亞單位疫苗候選抗原的可能性。
　　我們分析了30份DENV-1感染患者恢復(fù)期血清的中和活性與EDⅢ結(jié)合抗體滴度的關(guān)系，使用Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示患者血清與EDⅢ蛋白結(jié)合的抗體滴度遠(yuǎn)低于中和滴度，且兩者不相關(guān);說明EDⅢ抗體與DENV感染的中和保護(hù)性沒有關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步從30份患者血清中，隨機(jī)挑選6份去除患者血清中EDⅢ反應(yīng)抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除EDⅢ抗體前后，患者血

13、清對(duì)同型和異型DENV的中和活性與增強(qiáng)活性均沒有變化。說明DENV感染患者血清中EDⅢ抗體作用微弱，與其他研究團(tuán)隊(duì)結(jié)果相一致。兔抗DENV-1 EDⅢ血清對(duì)同型DENV的中和活性為較高稀釋度1∶50，000，增強(qiáng)活性較低為1∶5，000;值得注意的是，兔抗EDⅢ血清對(duì)異型DENV感染的增強(qiáng)峰值僅為1∶40，這提示EDⅢ免疫原免疫兔子，體內(nèi)產(chǎn)生的EDⅢ反應(yīng)抗體在二次異型感染中是安全的。去除兔抗EDⅢ血清的EDⅢ反應(yīng)抗體后，中和活性與增強(qiáng)活

14、性全部消失。這說明雖然DENV EDⅢ不是登革病毒自然感染過程中的主要抗原，但是純化或重組的DENV EDⅢ仍然能夠作為亞單位疫苗，刺激有效安全的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　小結(jié)：
　　本課題使用酵母表面展示蛋白技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得EDⅢ交叉反應(yīng)性抗體特異性識(shí)別高度保守的aa310-319序列的關(guān)鍵殘基，位于EDⅢ蛋白AB環(huán)的Q316和H317。為了全面評(píng)估DENV抗體和血清的增強(qiáng)感染的性能，首次建立基于NS1蛋白捕獲ELISA

15、的ADE檢測(cè)(ELISA-ADE)方法，在96孔板上實(shí)施高通量簡(jiǎn)便的檢測(cè)，與前期建立的檢測(cè)中和性能ELISPOT-MNT方法學(xué)聯(lián)合運(yùn)用，全面評(píng)價(jià)DENV抗體和血清的增強(qiáng)和中和保護(hù)性能。這進(jìn)一步為探索免疫治療性抗體，以及評(píng)估DENV疫苗的安全性和有效性提供有效的、高通量、簡(jiǎn)便的技術(shù)手段。在前期建立穩(wěn)定方法學(xué)的基礎(chǔ)上，使用重組DENVEDⅢ蛋白免疫家兔，獲得抗EDⅢ的兔多克隆抗體血清，證實(shí)抗DENV-1 EDⅢ兔血清中的EDⅢ反應(yīng)抗體在中和