人類免疫缺陷病毒重組包膜蛋白gp140的表達(dá)純化及活性鑒定.pdf

1、艾滋病(AIDS)自1981年被發(fā)現(xiàn)以來,便在世界范圍內(nèi)迅速蔓延,越來越多的人被人類免疫缺陷病毒(HIV)感染,人類健康和社會(huì)都受到了極大的危害。對(duì)HIV的有效控制、預(yù)防及治療是人類迫切想要解決的問題。HIV的包膜蛋白含有HIV最重要的抗原成分,同時(shí)也是其構(gòu)成成分中最容易變異的組分,對(duì)于HIV診斷試劑、中和抗體和疫苗的研究都至關(guān)重要,長期以來一直是HIV的研究熱點(diǎn)。然而HIV包膜蛋白的糖基化程度很高,且很難分泌表達(dá),這些都不利于蛋白的獲

2、取,對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的研究工作造成了阻礙。
　　 本研究通過對(duì)HIV包膜糖蛋白gp160進(jìn)行基因改造,獲得了能夠分泌表達(dá)且?guī)в蠬is-tag的穩(wěn)定的可溶性HIV包膜糖蛋白gp140。該蛋白去掉了gp41的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,對(duì)gp120末端的蛋白酶水解位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中常用的tPA信號(hào)肽代替gp160自身的信號(hào)肽,并在目的蛋白末端加入了純化標(biāo)簽His-tag,我們將其命名為gp140b2-his。
　

3、　 由于HIV包膜蛋白gp140對(duì)糖基化修飾水平要求很高,一般的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)難以勝任。本研究選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293-6E成功地分泌表達(dá)出糖基化完全的gp140b2-his,并對(duì)其瞬時(shí)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,采用真核表達(dá)載體pTT5,換用廉價(jià)的無血清培養(yǎng)基,以及使用改良的轉(zhuǎn)染方法,使得gp140b2-his產(chǎn)量提高且雜蛋白含量少。
　　 經(jīng)過粗純、鎳離子金屬螯合親和層析以及陰離子作用層析純化,獲得了純度高達(dá)85％以上且反應(yīng)性