重組人KGF-1蛋白的表達、純化及活性研究.pdf

1、角質(zhì)化生長因子(KGF-1)是成纖維母細胞生長因子家族(FGFs)的一員，又名成纖維細胞生長因子7(FGF-7)。其特異性受體FGFR2Ⅲb僅表達于各種上皮細胞，所以KGF-1僅特異作用于上皮細胞。這一特性使得KGF-1蛋白藥物在給藥時定向性更好，同時也更加安全。2004年，美國AMGEN公司研發(fā)的帕利夫明注射液（即Kepivance）通過FDA批準上市，適應癥為治療惡性血液病患者的嚴重口腔黏膜炎。KGF-1的潛在應用價值還還有治療由于

2、代謝疾病引起的慢性傷口愈合、早產(chǎn)兒表面活性劑的不足與支氣管肺發(fā)育不良、急性肺損傷、急性肝損傷的治療等。雖然KGF-1蛋白在醫(yī)學上有著很大的應用潛力，但是目前對于重組KGF-1蛋白表達的研究仍在處于探索階段。KGF-1蛋白已經(jīng)在大腸桿菌、CHO細胞及植物細胞等表達系統(tǒng)中進行過表達，結果都并不令人十分滿意。SUMO是一種類泛素蛋白，結構與泛素蛋白十分相似。與泛素化不同的是，生物體內(nèi)蛋白的sumo化(sumoylation)反應可以加強靶蛋白

3、的穩(wěn)定性、幫助靶蛋白正確轉(zhuǎn)運和折疊、影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性。近年來，SUMO蛋白融合標簽被越來越多的運用于表達一些過去難以表達的蛋白質(zhì)，顯著提高了這些蛋白的表達量及可溶性。
　　本研究應用重疊PCR技術，將poly His-sumo標簽基因序列與N端缺失23個氨基酸殘基的rhKGF-1基因序列拼接，構建融合基因6His-sumo-rhKGF1。將融合基因與非融合基因分別克隆至表達載體pET30a和pJW2上，構建重組表達載體。將重組

4、表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中表達重組蛋白，篩選表達量最高的重組表達質(zhì)粒。對得到的陽性重組表達質(zhì)粒進行密碼子優(yōu)化，同時嘗試通過改變誘導條件來提高蛋白表達量。工程菌經(jīng)誘導表達之后，進行超聲破碎處理，離心后，取上清經(jīng)鎳柱純化。收集純化得到的融合蛋白，SUMO Protease處理切除SUMO標簽，再經(jīng)鎳柱純化獲得rhKGF-1蛋白。利用人永生化表皮細胞（HaCat細胞）模型，經(jīng)CCK-8顯色，檢測rhKGF-1的生物活性。通過對

5、上述內(nèi)容的研究，得到以下結果:1.重組表達質(zhì)粒pET30a-rhKGF-1、pET30a-6His-sumo-rhKGF-1、pJW2-rhKGF-1、pJW2-6His-sumo-rhKGF-1經(jīng)雙酶切鑒定和測序驗證證明成功構建。通過誘導表達，篩選出陽性表達載體pET30a-6His-sumo-rhKGF-1。2.對融合基因進行了密碼子優(yōu)化，摸索了誘導表達的三個因素的條件，均未能提高融合蛋白的表達量。3.經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，重