重組人心肌肌鈣蛋白T的表達及純化.pdf

1、目的:
　　研究重組人心肌肌鈣蛋白T(Human cardiac troponin T，hcTnT)在大腸桿菌中的表達及純化，為進一步制備cTnT單克隆抗體及開發(fā)穩(wěn)定性良好的hcTnT檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.重組蛋白在大腸桿菌中的表達:將含有hcTnT基因片段的重組質(zhì)粒pET-15b-cTNNT2轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21(DE3)中表達，接種于含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，在對誘導(dǎo)劑IPTG的誘導(dǎo)濃度

2、及誘導(dǎo)時間優(yōu)化之后，將細(xì)菌裂解后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，鑒定重組蛋白是否在BL21(DE)中正常表達及其表達量，以及確定重組蛋白的可溶性。
　　2.純化重組蛋白:重組蛋白質(zhì)的N末端含有一個六個組氨酸的親和標(biāo)記，可以和金屬螯合物結(jié)合從而使重組蛋白和其他雜蛋白分離，純化目的蛋白。本實驗中重組蛋白在流過Ni-NTA柱后與柱上的鎳原子結(jié)合，非標(biāo)記蛋白隨流出液流出，經(jīng)過洗脫液洗去大部分雜蛋白，最后可以得到純度較高的重組蛋白。<

3、br>　　3.Western-blot鑒定純化后的蛋白是否為重組目的蛋白。
　　結(jié)果:
　　1.重組質(zhì)粒pET-15b-cTNNT2成功轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21(DE3)中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后獲得了較高的表達，用Bandscan5.0軟件檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達量占菌體總蛋白的8％左右。使用羅氏公司CobasE411電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀檢測也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌裂解液中有高濃度的肌鈣蛋白T。
　　2.利用鎳凝膠柱親和層析法純化