循環(huán)心肌肌鈣蛋白Ⅰ自身抗體檢測及對常用肌鈣蛋白Ⅰ檢測系統(tǒng)負性干擾評估.pdf

1、人心肌肌鈣蛋白(Cardiac Troponin)是心肌調(diào)節(jié)蛋白,其亞單位心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是具有210個氨基酸的多肽,相對分子量為24KD,僅存在于心房肌和心室肌。因cTnl的氨基端較骨骼肌TnI多31個氨基酸,兩者氨基酸序列的差異達40％,故具有較好的心肌特異性。心肌發(fā)生損傷時,釋放到人體血液循環(huán)中的cTnI既有游離形式,又有不同復(fù)合物的形式,包括cTnl-C、cTnI-T以及cTnI-ToC等,現(xiàn)已證實在人體循環(huán)的cTnI

2、中90％以上為cTnI-C二聚體復(fù)合物形式穩(wěn)定存在。 cTnI在心肌損傷時釋放入血,是心肌損傷敏感而特異的標志物,對于診斷急性冠狀動脈綜合癥患者(ACS)心肌缺血及危險分級具有重要意義。自1987年Cummins等報道以血清cTnI對心肌梗死進行診斷以來,cTnI已逐漸取代肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等心肌酶學(xué)指標,成為診斷心肌梗死的首要血清標志物,cTnI也是獨立于心電圖(E

3、CG)之外可用于判斷心肌梗死灶范圍大小及預(yù)后的重要血清學(xué)指標。同時,cTnI也用于評判不穩(wěn)定型心絞痛患者罹患心肌梗死和心源性死亡的危險率,亦是判斷冠心病患者是否應(yīng)接受抗凝藥物,如血小板糖蛋白II b/Ⅲa受體拮抗劑治療的唯一標志物。近年來,cTnI已開始為診斷病毒性心肌炎及判斷藥物、大手術(shù)創(chuàng)傷等所致心肌受損的診斷和嚴重程度等提供幫助。 cTnI檢測多采用雙抗體夾心法。最初檢測cTnI的捕獲抗體和標記抗體多為多克隆抗體,存在一定的

4、交叉反應(yīng),敏感性較差。隨著cTnI單克隆抗體的使用和檢測系統(tǒng)的不斷優(yōu)化,cTnI測定的敏感性和特異性大大提高,目前在國內(nèi)外被有關(guān)機構(gòu)批準用于臨床cTnI測定的檢測系統(tǒng)已達十余種。cTnI多肽鏈的大部分序列均具有抗原性,但其氨基末端和羧基末端的抗原性最強,從理論上講,cTnI檢測系統(tǒng)中的檢測抗體若針對上述區(qū)域抗原表位,將會達到最好的檢測效果。然而,cTnI分子的氨基末端和羧基末端很容易受到蛋白水解酶水解而降解,無疑會直接影響測定結(jié)果。在c

5、TnI肽鏈中心區(qū)域(第30～110位氨基酸殘基)因受到TnC亞基的保護,穩(wěn)定性明顯提高。因此選用針對cTnI肽鏈中心區(qū)域的抗體組成的檢測系統(tǒng),可以較好地消除cTnI分子降解而對結(jié)果造成的影響。2007年國際臨床化學(xué)學(xué)會最新發(fā)布的急性冠脈綜合征和心力衰竭的臨床實驗室診斷指導(dǎo)原則指出,cTnI試劑生產(chǎn)廠家應(yīng)優(yōu)先選擇針對cTnI中心穩(wěn)定區(qū)域的抗體作為檢測抗體。然而進一步的研究揭示,即使是選擇針對cTnI中心穩(wěn)定區(qū)域的捕獲抗體和檢測抗體而建立的

6、檢測系統(tǒng),也會受到多種干擾因素的影響使cTnI檢測值假性升高或降低。由于cTnI在正常人血循環(huán)中濃度非常低,故cTnI檢測系統(tǒng)的臨床臨界值也比較低,其假陰性或者假陽性干擾很容易誤導(dǎo)臨床診斷。鑒于cTnI檢測在診斷心肌損傷中的重要作用和對于治療的重要指導(dǎo)作用,充分認識cTnI檢測中的任何干擾都是十分必要的。研究發(fā)現(xiàn),除了在免疫學(xué)測定中常見的異嗜性抗體、類風(fēng)濕因子、纖維蛋白原、黃疸、血紅蛋白、抗凝劑等干擾因素外,cTnI自身抗體引起的負性干

7、擾尤為嚴重。在生理狀態(tài)下,cTnl為隔絕免疫系統(tǒng)的隱蔽抗原,在某些病理條件下,由于心肌細胞的損傷和破壞導(dǎo)致cTnI釋放入血,引發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生cTnI自身抗體。1996年Bohner等首次報道了cTnI檢測中cTnI自身抗體引起的負性干擾現(xiàn)象,隨后研究發(fā)現(xiàn)cTnI自身抗體恰好特異性封閉cTnI的第30～110位中心穩(wěn)定氨基酸殘基區(qū)域的抗體結(jié)合位點,影響了檢測抗體與循環(huán)中cTnI結(jié)合而導(dǎo)致其測定值假性降低。2005年Eriksson等采

8、用回收試驗等方法,初步發(fā)現(xiàn)約有3.2％的胸痛患者可能因為受到cTnI自身抗體的負性干擾使其血清cTnI檢測的回收率小于10％。既然血清中cTnI自身抗體對cTnI的檢測可以造成如此大的影響,但急性心肌梗死(AMI)或心肌炎等心肌損傷患者血清中cTnI自身抗體陽性率到底是多少?cTnI自身抗體滴度與cTnI測定負性干擾嚴重程度是否相關(guān)?其對當(dāng)前各個cTnI檢測系統(tǒng)中的干擾程度究竟如何?本課題旨在給這些疑問尋找答案。本研究結(jié)果對cTnI檢測

9、和結(jié)果的臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義,同時也為cTnI檢測試劑盒的研發(fā)和改善提供側(cè)重點。 第一部分：人心肌肌鈣蛋白I-C(cTnI-C)融合蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中的可溶性表達及純化 本部分實驗?zāi)康氖菫榻⒑Y查cTnI自身抗體的EIJSA方法制備包被抗原。根據(jù)心肌損傷患者血清中cTnI主要以cTnI-C復(fù)合物形式存在,且與TnC形成復(fù)合物后穩(wěn)定性增加,不易被蛋白酶水解的特點,構(gòu)建cTnI和TnC融合蛋白原核表達載體。采用硫氰酸

10、胍-酚氯仿一步法提取(TRIzol試劑,美國GIBCO BRL公司)人心肌組織總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR,日本TaKaRa公司RT-PCR試劑盒)擴增包含cTnI和TnC開放閱讀框的650bp和500bp序列,中間用19個中性氨基酸為主的短肽將cTnI和TnC連接到一起,構(gòu)建全長cTnI-C融合蛋白的pET28原核表達系統(tǒng),在大腸桿菌中進行可溶性表達。目的蛋白氨基端帶有組氨酸“標簽”(H

11、is-tag),采用Ni2+金屬螯合親和層析純化。純化產(chǎn)物鑒定結(jié)果:純化產(chǎn)物經(jīng)12％十二烷基磺酸鈉.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示在相對分子量為43KD附近有清晰目的蛋白表達條帶,灰度掃描目的蛋白純度為86.9％。進一步使用鼠cTnI單抗(長海醫(yī)院實驗診斷科惠贈)進行蛋白質(zhì)印跡分析(Western Blot),在相對分子量為43KD附近顯示單一印跡,無降解條帶。融合蛋白于-80℃冰箱分裝凍存,實驗過程中采用Access-2(

12、美國Backman Coulter公司)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及AccuTnI試劑盒監(jiān)測cTnI濃度,cTnI-C融合蛋白穩(wěn)定無降解。 第二部分:建立檢測人cTnI自身抗體的間接ELISA方法 本部分實驗以第一部分實驗中重組表達的cTnI-C融合蛋白包被96孔聚苯乙烯板,以鼠抗人cTnI單克隆抗體為一抗確定cTnI-C融合蛋白的包被濃度,初步建立檢測cTnI抗體的間接ELIA方法。使用該方法對長海醫(yī)院80名AMI患者血

13、清進行盲篩,從中選出一份在450nm波長時吸光度(A450nm)最高的血清,該血清經(jīng)Western Blot鑒定,可與cTnI-C融合蛋白聚丙烯凝膠電泳(PAGE)后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上相對分子量為43KD的目的蛋白特異結(jié)合,將此血清確定為陽性血清。收集長海醫(yī)院210名健康體檢者血清,做為陰性血清,進一步優(yōu)化檢測cTnI自身抗體的間接ELISA法。 通過棋盤滴定實驗,檢測cTnI自身抗體的間接ELISA法的最佳工作條件為:包被抗

14、原濃度為10μg/L,血清稀釋度為1:50,酶標二抗(辣根過氧化物酶HRP標記羊抗人IgG,美國KPL公司)稀釋度為1:8000。陽性血清在450nm處的吸光度(A450nm)均值為1.52。210份陰性血清的A450nm為0.19,SD為0.12,陽性臨界值設(shè)定為陰性均值A(chǔ)450nm+3SD,即0.55。 第三部分:AMI和心肌炎患者中cTnI自身抗體陽性率的篩查和確認收集長海醫(yī)院心內(nèi)科121名AMI患者血清(既往診斷為冠心病

15、、心絞痛的63名,陳舊性心梗的47名；有心臟手術(shù)史的21名)、24名心肌炎患者(有心肌炎病史的13名,否認有心肌炎病史的11名)血清和210名年齡、性別相匹配的健康體檢者血清,采用第二部分實驗中所建立的檢測cTnI自身抗體的間接ELISA方法進行cTnI自身抗體的篩查。ELISA檢測陽性的血清進一步采用Western Blot進行確證。對ELISA和Western Blot檢測均為陽性的血清,取其中1份加入不同濃度的cTnI-C融合蛋白

16、,在Access-2上進行cTnI劑量依賴實驗,驗證cTnI與cTnI自身抗體的結(jié)合特異性。 第四部分:cTnI自身抗體對常用cTnI檢測系統(tǒng)負性干擾評估 在確證為cTnI自身抗體陽性的13份AMI患者血清中加入cTnI終濃度為20μg/L的重組cTnI-C融合蛋白,在上海市5個主要的cTnI檢測系統(tǒng)上進行回收試驗(2名cTnI自身抗體陽性的心肌炎患者分別是3歲和4歲,未能采集足夠的血清進行本部分實驗)。5家cTnI檢測

17、系統(tǒng)分別為:Access-2(Backman Coulter),臨床診斷值0.1μg/L;Vidas(Biomerieux),臨床診斷值0.1μg/L;Architect i2000(Abbott),臨床診斷值0.3μg/L;Axsym(Abbott),臨床診斷值2.3μg/L;Dimension X Pand(Dade Behring),臨床診斷值0.15μg/L。設(shè)回收率0～50％為低回收率,50～80％為中等回收率,>80％為正常