畢赤酵母表達的重組人干擾素λ1(IL-29)的表達、純化及抗腫瘤活性的初步研究.pdf

1、IFN—λs是最新發(fā)現(xiàn)的一類具有抗病毒活性的干擾素樣細胞因子，包括IFN—λ1(IL—29)、IFN—λ2(IL—28A)和IFN—λ3(IL—28B)。IFN—λs在基因結構上與IL—10家族十分相似，而在氨基酸組成和功能方面與I型IFN更為接近，在IL—10家族和I型IFN之間建立了進化上的聯(lián)系。因此IFN—λ1具有開發(fā)成抗病毒抗腫瘤藥物的潛在價值。
　　 本組前期工作中通過RT—PCR從人外周血淋巴細胞中克隆了IFN—λ1

2、 cDNA，通過基因重組及酵母表達技術，已設計并表達了一種新的重組人干擾素λ1(IL—29)蛋白。前期工作表明，該重組蛋白能夠在畢赤酵母中正確分泌性表達，具有能夠誘導Hela細胞內的STAT1磷酸化的生物學活性。本論文在此基礎上，對重組人干擾素λ1的表達純化，理化性質鑒定，受體分布和抗腫瘤生物活性幾個方面進行了進一步的探索。
　　 本論文的第一部分工作是使用本組保存的含pA0815—4αF—IFNλ1表達質粒的甲醇營養(yǎng)型酵母菌種

3、，通過BMG培養(yǎng)，在BMMY中進行誘導表達，其中低糖基化20kD rhlFN—λ1表達水平約為9.32mg/L，表達產(chǎn)物經(jīng)SPFF陽離子交換層析及Superdex75分子篩層析純化，和HPLC鑒定，獲得較純的重組人IFN—λ1(recombinant humanIFN—λ1，rhIFN—λ1)蛋白。對純化程序作了產(chǎn)率，純度分析，并對重組蛋白作了質譜，N端測序，等電點等理化性質的鑒定。
　　 IFN—λs受體隸屬于II型細胞因子受

4、體家族，由兩個亞基構成，即IL—28R(或稱CRF2—12)和IL—10R2(或稱CRF2—4)。其中IL—28R是IFN—λs受體特有的亞基，CRF2—4最早是作為IL—10受體(IL—10R)的小亞基被發(fā)現(xiàn)的，故又稱為IL—10R2，同時IL—10R2還是IL—22R和IL—26R的共有亞基。本論文的第二部分工作是通過RT—PCR及實時熒光定量PCR(Real—time fluorescent quantitative PCR)方法

5、，對三個腫瘤細胞系進行了IFN—λR復合物表達特異性的鑒定。RT—PCR檢測IL—28R在兩株實體瘤細胞株：人宮頸癌細胞株Hela及人結腸癌細胞株HCT116中均有表達，但在骨髓造血系統(tǒng)來源的人淋巴瘤細胞株U937細胞中未檢測到表達。實時熒光定量PCR對Hela、HCT116、U937細胞以各自的GAPDH為參照計算各自IL—28R基因的相對表達量。結果顯示，Hela和HCT116細胞中IFN—λs特異的受體大亞基IL—28R的相對表達

6、量遠高于U937中的相對表達量。
　　 分別以Hela、HCT116及U937細胞為實驗對象。MTT比色實驗發(fā)現(xiàn)，IFN—λ1在10、100和1000ng/ml三個不同濃度對Hela細胞增殖的抑制率分別為15.20±4.73％，16.57±9.80％和25.88±12.48％：對HCT116細胞增殖的抑制率分別為11.62±10.08％，1.83±2.46％和21.22±6.48％，高于其對U937細胞增殖的抑制率11.46±3

7、.48％，13.46±3.83％和8.87±2.73。相反，對照組IFN—α2a1000IU/ml對U937細胞增殖的抑制率20.39±1.24％，高于其對于Hela和HCT116細胞增殖的抑制率7.25±1.58％和6.52±1.87％。因此IFN—λ1因其IL—28R表達水平和組織分布的特異性顯示了與IFN—α差異的抗腫瘤活性。
　　 上述研究結果為促進IFN—λ1的純化、性質、功能的研究打下了基礎，對其由于受體分布特異的原