重組人白蛋白融合干擾素在畢赤酵母中的表達及穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的：用電轉化方法將線性化重組表達載體質粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b轉化整合入畢赤酵母宿主菌SMD1168，甲醇誘導表達出具有生物活性的目的蛋白，并對轉化子表達條件及遺傳穩(wěn)定性進行初步研究。 方法：提取重組表達質粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b，小量限制性內切酶雙酶切鑒定，鑒定后的重組質粒進行限制性內切酶SalI酶切線性化，純化經(jīng)單酶切線性化的重組表達質粒DNA并電轉化巴斯德畢赤酵母菌(PPastoris)SMD

2、1168。將陽性轉化子進行PCR鑒定和Mut表型鑒定并用甲醇誘導表達，將表達上清進行Western-Blot鑒定，抗G418抗性鑒定及用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定融合干擾素的表達水平。Wish細胞-VSV病毒系統(tǒng)的細胞病變抑制法(CPE)測定表達蛋白的抗病毒活性及其效價。在搖瓶培養(yǎng)條件下，初步研究了甲醇誘導濃度及菌體誘導起始OD600值兩因素對轉化子表達水平的影響。最后，對轉化子基因及表達水平的遺傳穩(wěn)定性進行鑒定。 結果：

3、通過電轉化方法成功將酶切線性化重組表達質粒DNA整合入宿主菌基因組，并在甲醇誘導條件下成功表達出具有生物學活性的目的蛋白。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)及Wish細胞-VSV病毒系統(tǒng)對目的蛋白的表達水平及抗病毒活性進行了測定，表達量和比活分別是300mg/L和1.1×107IU/mg。搖瓶條件下，通過對甲醇誘導濃度及誘導起始OD600值兩因素對轉化子表達水平的影響的初步研究，我們發(fā)現(xiàn)：在0.5％～4.0％的范圍，隨著甲醇誘導濃度的升高蛋白表