重組人白蛋白干擾素α-2b融合蛋白的純化及蛋白穩(wěn)定性研究.pdf

1、重組人白蛋白干擾素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)是采用基因融合技術(shù)研制而成,臨床適應(yīng)癥包括腫瘤、慢性乙型、丙型病毒性肝炎及其它病毒感染性疾病。相對(duì)于普通干擾素而言,重組人白蛋白融合干擾素是長效制劑,其臨床和社會(huì)效益十分顯著。
　　本文采用親和層析方法,對(duì)重組人白蛋白干擾素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)進(jìn)行純化研究。比較了3D9單克隆抗體免疫親和層析和blue sepharose6 fast flow染料

2、親和層析兩種親和層析體系的純化效果,并對(duì)rHSA-IFNα-2b蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行了較全面的研究。
　　利用3D9單克隆抗體親和層析技術(shù)純化rHSA-IFNα-2b融合蛋白,實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)rHSA-IFNα-2b融合蛋白發(fā)酵液上清可直接上樣于3D9單抗親和層析柱,以含有500mmol/L NaCl+0.5％Tween20+50mmol/L Gly的20mmol/L PB洗滌層析柱,洗去非特異性吸附的雜蛋白,隨后用20mmol/L PB

3、平衡單抗柱,以500mmol/L NaCl+20mmol/L PB+1.5％HAC+0.5％Tween20+50mmol/L Gly進(jìn)行洗脫。純化后的rHSA-IFNα-2b經(jīng)SDS-PAGE電泳和HPLC分析,純度達(dá)到95％。3D9單抗親和層析柱對(duì)rHSA-IFNα-2b融合蛋白飽和吸附量為8mg/ml。經(jīng)rHSA-IFNα-2b體外生物學(xué)活性檢測(cè),蛋白活性為2.45×105IU/ml,折合成單位比活為6.8×105IU/mg,蛋白回

4、收率為81％,活性回收率為35.8％。
　　選用blue sepharose6 fast flow親和層析柱對(duì)rHSA-IFNα-2b進(jìn)行純化。本文首先研究了吸附條件,研究發(fā)現(xiàn),rHSA-IFNα-2b融合蛋白發(fā)酵液上清不能直接吸附于blue sepharose6 fast flow柱上,直至發(fā)酵液上清稀釋1倍體積。隨后研究了離子濃度對(duì)洗脫效果的影響,最終選擇在2mol/L NaCl+20mmol/L PB條件下洗脫。純化后的rH

5、SA-IFNα-2b經(jīng)SDS-PAGE電泳和HPLC分析,純度達(dá)到84％左右。Blue sepharose6 fast flow親和層析柱對(duì)目的蛋白的飽和吸附量為6.6mg/ml。經(jīng)rHSA-IFNα-2b融合蛋白體外生物學(xué)活性檢測(cè),蛋白活性為3.29×105IU/ml,折合成單位比活為7.3×105IU/mg,蛋白回收率為67％,活性回收率為38.4％。
　　將兩種親和層析柱純化效果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)3D9單抗親和層析柱特異性吸附力

6、強(qiáng),蛋白回收率高,蛋白純度好,僅經(jīng)過一步單克隆抗體親和層析純化,目的蛋白的純度就可達(dá)到95％。但是利用單克隆抗體親和層析凝膠,生產(chǎn)成本較大,而blue sepharose6 fast flow染料親和層析具有生產(chǎn)成本優(yōu)勢(shì),其配基價(jià)格相對(duì)低廉,可望降低分離成本。發(fā)酵液經(jīng)blue sepharose6 fast flow親和層析純化后,目的蛋白純度達(dá)到84％左右,可再經(jīng)過疏水層析,離子交換層析等方法達(dá)到更高純度,因此blue sepharo

7、se6 fast flow染料親和層析可以作為生產(chǎn)上替代單克隆抗體親和層析的一種方法。
　　對(duì)rHSA-IFNα-2b融合蛋白穩(wěn)定性的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rHSA-IFNα-2b低溫儲(chǔ)藏具有良好的穩(wěn)定性,并對(duì)一定范圍內(nèi)的溫度、酸堿變化也表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。rHSA-IFNα-2b反復(fù)凍融后有聚合體產(chǎn)生,凍融次數(shù)增加,聚合體含量隨之增加,凍融4次后聚合體含量可達(dá)17.91％,rHSA-IFNα-2b融合蛋白溶液對(duì)凍融很敏感,隨著溫度的