重組人干擾素-γ的蛋白折疊液相色譜法.pdf

1、依據(jù)蛋白質(zhì)在液相色譜上的折疊機(jī)理，通過對(duì)重組人干擾素-γ(recombinanthuman interferon-γ，rhIFN-γ)包涵體抽提液的疏水色譜復(fù)性并同時(shí)純化研究，著重探討了用蛋白折疊液相色譜法(protein folding liquid chromatography,PFLC)提高復(fù)性并同時(shí)純化rhIFN-γ的效率和在用Ecoli生產(chǎn)的重組蛋白復(fù)性時(shí)蛋自質(zhì)量回收率的方法。 本論文包括以下六部分：1、文獻(xiàn)綜述：簡

2、要介紹了我國重組蛋白藥物的概況和重組蛋白復(fù)性的意義，對(duì)近年來重組蛋白及rhlFN-γ的復(fù)性方法進(jìn)行了系統(tǒng)地介紹。引用文獻(xiàn)137篇。 2、對(duì)蛋白質(zhì)折疊的理論基礎(chǔ)，特別是蛋白質(zhì)的疏水色譜折疊機(jī)理進(jìn)行了詳述，依此為本研究的理論依據(jù)。 3、為找出用PFLC對(duì)rhIFN-γ進(jìn)行疏水色譜復(fù)性并同時(shí)純化過程中蛋白質(zhì)量的損失原因，分別在疏水性不同的七種疏水色譜固定相(PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-1000、乙氧

3、基、糠醇和苯基)上進(jìn)行了rhlFN-γ抽提液進(jìn)樣量大小的選擇實(shí)驗(yàn)。在保證高濃度變性劑7.0 mol.L-1 鹽酸胍(GUHCl)和雜蛋白的質(zhì)量或體積突破不影響rhIFN-γ在該七種色譜柱上保留的情況下，確定了最佳進(jìn)樣體積。通過對(duì)rhIFN-γ純度、比活和質(zhì)量回收率影響結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)端基為PEG-200的固定相更佳，可作為復(fù)性并同時(shí)純化rhlFN-γ的首選疏水色譜固定相(stationaryphase ofhydrophobic int

4、eraction chromatography，STtHIC)。同時(shí)，考察了不同疏水性的STHIC對(duì)重組人干細(xì)胞因子(recombinant human stem cell factor，rhSCF)的分離并同時(shí)純化效率，再次驗(yàn)證了疏水性弱的STHIC有利于重組蛋白的復(fù)性并同時(shí)純化的事實(shí)。 4、在PEG-200的STHIC上，也考察了疏水色譜流動(dòng)相組成、梯度模式、流速和pH對(duì)復(fù)性并同時(shí)純化rhlFN-γ的純度、比活和質(zhì)量回收率的

5、影響，進(jìn)一步優(yōu)化了復(fù)性并同時(shí)純化rhlFN-γ的色譜條件，為rhlFN-γ,的規(guī)?；瘡?fù)性并同時(shí)純化奠定了基礎(chǔ)。 5、在優(yōu)化后的色譜條件下，用端基為PEG200的STHIC對(duì)rhlFN-γ,粗提物復(fù)性并同時(shí)純化制備的rhlFN-γ，再經(jīng)過尺寸排阻色譜除鹽和冷凍干燥后得到rhtFN-γ/半成品，并對(duì)rhIFN-γ半成品進(jìn)行了色譜和質(zhì)譜鑒定。結(jié)果為：一步復(fù)性并同時(shí)純化rhlFN-γ的質(zhì)量回收率達(dá)到93.7％,純度>95％，比活為4.3

6、x107I.U./mg；經(jīng)Sephadex G-25色譜柱除鹽后的rhlFN-γ質(zhì)量回收率為92.0％，純度也在95％以上；冷凍干燥后的rhIFN-γ，單體純度>95％，二聚體純度<4.5％，比活為9.5x108 I.U./mg。最后，通過與文獻(xiàn)工藝的比較，證明用該工藝制備rhIFN-γ,是一條簡單、高效的工藝路線。 6、對(duì)蛋白質(zhì)在色譜餅上的分離性能及其影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果進(jìn)一步證明了色譜餅具有快速分離、大體積進(jìn)樣和適宜于對(duì)