柱層析法復(fù)性重組人γ-干擾素包涵體研究.pdf

1、γ-干擾素(IFN-γ)是一種細(xì)胞因子,由兩個(gè)相同的亞基組成同型二聚體結(jié)構(gòu),它在細(xì)胞對(duì)病毒入侵和分枝桿菌感染的免疫響應(yīng)機(jī)制中扮演著重要的角色,在臨床上IFN-γ可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核分枝桿菌感染、黑熱病等疾病?；蛑亟M人γ-干擾素(rhIFN-γ)的大量生產(chǎn),解決了天然γ-干擾素來源稀少,價(jià)格昂貴的難題。但是利用E.coli表達(dá)的重組人γ-干擾素,常以包涵體形式存在,需要經(jīng)過體外重折疊復(fù)性后才能恢復(fù)其生物活性。
　　本文采

2、用層析復(fù)性方法,對(duì)重組人γ-干擾素的體外重折疊復(fù)性進(jìn)行了研究,尋求較優(yōu)的復(fù)性條件,以期為蛋白質(zhì)復(fù)性提供一種簡便且適宜大規(guī)模應(yīng)用的方法。用3.7L發(fā)酵罐制備得到了重組人γ-干擾素包涵體,目標(biāo)蛋白的表達(dá)量占總蛋白的60％,經(jīng)過破胞離心,lL發(fā)酵液可以得到1.6g粗制包涵體。重組人γ-干擾素包涵體經(jīng)過含0.5%Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl,pH8.0洗滌純化后,溶于含8M尿素的溶解液,蛋白純度可達(dá)85%左右。

3、以尿素梯度離子交換層析(IEC)作為蛋白質(zhì)復(fù)性系統(tǒng),能有效地復(fù)性重組人γ-干擾素包涵體,實(shí)現(xiàn)復(fù)性和純化的過程集成化。在蛋白上樣量2.5mg、流速0.5mL/min、尿素梯度長度3.4CV、尿素終濃度為2 mol/L的條件下,復(fù)性后人γ-干擾素的比活為7.5×10～5 IU/mg,蛋白收率為54%,經(jīng)SDS-PAGE分析純度大于95%。利用疏水作用層析(HIC)法對(duì)重組人γ-干擾素進(jìn)行了復(fù)性,采用等尿素梯度和線性尿素梯度兩種復(fù)性方法,考察

4、了線性尿素梯度下尿素梯度長度、尿素終濃度、流速和上樣量對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性的影響。在優(yōu)化的線性尿素梯度復(fù)性條件下,重組人γ-干擾素活性收率比稀釋復(fù)性法提高6.5倍,蛋白質(zhì)量回收率為36%。在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)固定化小分子伴侶復(fù)合柱法復(fù)性重組人γ-干擾素進(jìn)行了探索性研究,將本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的小分子伴侶sht GroEL191-345固定化在Ni-NTA親和凝膠柱中,并與體積排阻層析柱(SEC)串聯(lián)使用。
　　結(jié)果表明,該復(fù)性方法中SEC柱能避