儀器分析07-3-液相色譜法

1、液相色譜法,Liquid Chromatography,簡(jiǎn)介,最早發(fā)明的色譜法（俄國(guó)植物學(xué)家分離植物色素）直到1960年代后期才普及，因?yàn)槭艿讲牧虾拖鄳?yīng)技術(shù)的限制實(shí)現(xiàn)了高速化，HPLC（high performance liquid chromatography or high pressure LC)和GC相比液體流動(dòng)相選擇余地大，可以用以控制和改進(jìn)分離條件通常在常溫下進(jìn)行對(duì)象范圍大（80%的有機(jī)物）目前運(yùn)用最廣最多的色

2、譜,1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法,高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá) 103cm·min-1.例如分離苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需1min就可完成。對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長(zhǎng)約170cm，柱徑0.9cm，流動(dòng)相速度為30cm3·h-1

3、，需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需1h之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分.,2．高效液相色譜法與氣相色譜法,（1）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分

4、離和分析。 (2)氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒(méi)有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)。因此，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。,(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。

5、 總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。 高效液相色譜法的儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。,HPLC儀器,,HPLC和經(jīng)典LC,Classic LC：重力洗脫,HPLC：高壓、

6、高效、高速,HPLC儀器組成,HPLC——高壓輸液系統(tǒng),高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性梯度淋洗裝置特別需要用于組分復(fù)雜、容量因子寬的樣品,HPLC——進(jìn)樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓

7、的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：,HPLC——分離柱,柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6 mm，柱長(zhǎng)5～40 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。,HPLC——檢測(cè)器Detector,理想的HPLC檢測(cè)器要求靈敏度高對(duì)所有的溶質(zhì)都有快速響應(yīng)響應(yīng)對(duì)流

8、動(dòng)相流量和溫度變化不敏感不引起柱外譜帶擴(kuò)展線性范圍寬使用范圍廣至今沒(méi)有一種檢測(cè)器能夠類似于GC中的TCD和FID，做到以上的這些要求。,在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測(cè)器。一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等。,HPLC——檢測(cè)器Detector,HPLC

9、——UV detector,紫外（可見(jiàn)）吸收檢測(cè)器：UVD應(yīng)用最廣（70%）需要組分對(duì)紫外光（可見(jiàn)光）有吸收固定波長(zhǎng)，可調(diào)波長(zhǎng)，光電二極管陣列三類 特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm × 10mm ，容積 8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。,HPLC——Fluorescence Detector,熒光檢測(cè)器（FD）選擇性濃度型高靈敏度，高選擇性

10、對(duì)象發(fā)射熒光的物質(zhì)利用熒光試劑修飾的物質(zhì)比UVD檢測(cè)靈敏度高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到10-12~10-13g/cm3可以梯度淋洗一般用于檢測(cè)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等,HPLC——示差折光檢測(cè)器,differential refractive index detector通過(guò)連續(xù)檢測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率（refractive index）的差別來(lái)測(cè)定濃度的。通用型檢測(cè)

11、器檢測(cè)的化合物范圍廣檢測(cè)靈敏度在10-7g/cm3缺點(diǎn)是對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗有反射、偏轉(zhuǎn)和干涉三種類型,HPLC——其他檢測(cè)器,電導(dǎo)檢測(cè)器選擇性檢測(cè)器在離子色譜儀中應(yīng)用最多缺點(diǎn)是受溫度影響大，而且在pH>7時(shí)不靈敏蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器根據(jù)不蒸發(fā)的溶質(zhì)微小顆粒對(duì)激光的散射來(lái)檢測(cè)只跟溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量有關(guān)，與溶質(zhì)的化學(xué)組成無(wú)光不能鑒別化學(xué)成分,HPLC中的固定相和流動(dòng)相,stationary p

12、hase and mobile phase,Stationary phase 固定相,需要承受高壓，按承受高壓能力分剛性固體，以SiO2為基質(zhì)，應(yīng)用最廣泛，可以通過(guò)鍵合擴(kuò)大應(yīng)用范圍硬膠，由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成按孔隙深度分類表面多孔型：多孔層厚度小，孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速柱效高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)迅速達(dá)平衡，適合做常規(guī)分析。但最大允許量受限。全多孔微粒型：由硅膠微粒凝聚而成。由于顆粒很細(xì)，孔

13、仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速，適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。,Mobile phase 流動(dòng)相,由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)

14、的輻射通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。,Mobile phase 流動(dòng)相,（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50～1OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（

15、5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過(guò)于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離.,HPLC的主要類型和原理,Basic principle and main types,主要類型,液固吸附色譜液液分配色譜化學(xué)鍵合色譜尺寸排阻色譜親和色譜離子色譜,一、液固吸附色譜（LSAC）,液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常

16、是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離的。原理： X + nSad = Xad + nS,達(dá)平衡時(shí),有其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過(guò)吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。,LSAC——固定相,吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸

17、膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點(diǎn)，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。,LSAC——流動(dòng)相,一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試

18、樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ε0）來(lái)衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。表14-6列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）。,二、液液分配色譜（LLPC）,在液-液色譜中,流動(dòng)相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無(wú)論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。

19、分離原理： 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。,LLPC——固定相,由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定相選擇較簡(jiǎn)單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問(wèn)題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液β，β′一氧二丙睛，中

20、等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取榱烁媒鉀Q固定液在載體上流失問(wèn)題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分離問(wèn)題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。,LLPC——流動(dòng)相,在液液色譜中為了避免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)

21、基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶，而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好。正向分配色譜：流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，用于分離極性化合物。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。反向分配色譜：流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，用于分離非極性化合物。其流出順序與正相色譜恰好相反。,三、化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）,采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度

22、淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。用來(lái)制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分子成鍵,即可得到各種性能的固定相?；鶊F(tuán)類型有：疏水基團(tuán)：不同鏈長(zhǎng)的烷烴和苯基等極性基團(tuán)：醚和醇、氨丙基、氰乙基等離子交換基團(tuán)：陰離子交換基團(tuán)的氨基、季銨鹽；陽(yáng)離子交換基團(tuán)的磺酸基等,CBPC——固定相的制備,硅酸酯（≡Si一O

23、R）鍵合固定相 ≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過(guò)的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相?！許i－C或Si一N共價(jià)鍵合固定相共價(jià)鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制pH在4～8范圍內(nèi).,CBPC——固定相的制備,硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相這類鍵會(huì)

24、固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70℃以下，PH=2～8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛.,CBPC——正相鍵合相色譜法,此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙晴.等）為流動(dòng)相，分離極性化合物。此時(shí)，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。 這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)

25、體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。,CBPC——反相鍵合相色譜法,此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流動(dòng)相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。,四、尺寸排阻色譜法（SEC）,siz

26、e exclusion chromatography尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，具有其他LC法所沒(méi)有的特點(diǎn)：保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低的檢測(cè)器固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留

27、分子，因此柱壽命長(zhǎng)。,SEC——分離原理（分子篩效應(yīng)）,其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。。,SEC——固定相,固定相凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。 （1）軟性凝膠 如葡聚

28、糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 （2）半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。用于高效液相色譜時(shí)，流速不宜大。 （3）剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相

29、，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。一般控制壓強(qiáng)小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。,SEC——流動(dòng)相,排阻色譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤(rùn)濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時(shí)，溶劑也必須能溶脹凝膠。溶劑的粘度要小，因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果。這對(duì)于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢定器相匹配。常用的流動(dòng)相有四氫呋喃

30、、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。以水溶液為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。,五、親和色譜法（AC）,Affinity chromatography利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離通常是在載體（無(wú)機(jī)或有機(jī)填料）表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的

31、生物大分子相互作用而被保留，沒(méi)有這種作用的分子不被保留。,六、離子色譜法（IC）,Ion chromatography由離子交換色譜法派生出來(lái)，用于檢測(cè)分離離子性物質(zhì)1975年Small等人實(shí)現(xiàn)的單柱離子色譜法（single column IC or non-suppressed IC）和雙柱離子色譜法（double column IC or suppressed IC）特點(diǎn)：分析速度快，檢測(cè)靈敏度高，選擇性好，多離子可以同時(shí)分

32、析，穩(wěn)定性高是離子性物質(zhì)，特別是無(wú)機(jī)陰離子的最佳分離分析方法,IC——分類,按分離機(jī)理分成許多類，同時(shí)結(jié)合正相反相組成了更多種的離子色譜法。以下幾種為比較常用的：離子交換色譜法（ion exchange chromatography, IEC)電場(chǎng)相互作用+非離子性的吸附過(guò)程離子排斥色譜法（ion chromatography exclusion, ICE）Donnan膜平衡、體積排阻和分配過(guò)程離子對(duì)色譜法（ion pai

33、r chromatography, IPC）吸附與分配具體的介紹可以參考書本或其他的資料。,IC儀器的基本構(gòu)成,以上為抑制型，，去掉抑制器、再生液和再生泵則為非抑制型,各種液相色譜法的比較,HPLC條件和類型的選擇,,影響HPLC分離效果的因素,在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬(wàn)分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u較小，可以忽略不計(jì)，即： H = A + C u故液相色

34、譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色譜中，不可能通過(guò)增加柱溫來(lái)改善傳質(zhì)。恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。,影響HPLC分離效果的因素,流速大于0.5 cm/s時(shí), H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇

35、參數(shù)。,氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。,分離類型的選擇,1．根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇 相對(duì)分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是20O～2000。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。,2．根據(jù)溶解度選擇

36、 弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果樣品可溶于水井屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時(shí)，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動(dòng)相，以憎水性化合物作固定相。,3．根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇 用紅外光譜法，可預(yù)先簡(jiǎn)單地判斷樣品中存在什么官

37、能團(tuán)。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構(gòu)體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的用液一液分配色譜。,HPLC分離類型選擇,HPLC的應(yīng)用,1. 環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 ～50?m) 流動(dòng)相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：5

38、0cm?2.5mm(內(nèi)徑) 檢測(cè)器：差示折光檢測(cè)器,可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。,2. 稠環(huán)芳烴的分析,稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。,固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動(dòng)相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 ºC 柱 壓：70 ?104 Pa 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器,超臨界流體色譜法

39、（SFC）,Supercritical fluid chromatography,超臨界流體色譜法,超臨界流體色譜法（Supercritical Fluid Chromatography ,SFC）是以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜方法。所謂超臨界流體，是指既不是氣體也不是液體的一些物質(zhì)，它們的物理性質(zhì)介于氣體和液體之間。超臨界流體色譜技術(shù)是2O世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種嶄新的色譜技術(shù)。由于它具有氣相和液相所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，并能分離和分析氣

40、相和液相色譜不能解決的一些對(duì)象，應(yīng)用廣泛，發(fā)展十分迅速。據(jù)估計(jì)，至今約有全部分離的25％涉及難以對(duì)付的物質(zhì)，通過(guò)超臨界流體色譜能取得較為滿意的結(jié)果。,一．超臨界流體的特性,(1) 物質(zhì)的臨界點(diǎn) 我們知道，某些純物質(zhì)具有三相點(diǎn)和臨界點(diǎn)。純物質(zhì)的相圖見(jiàn)圖20-s1由三相圖看出：物質(zhì)在三相點(diǎn)下，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)。而在物質(zhì)的超臨界溫度下，其氣相和液相具有相同的密度。當(dāng)處于臨界溫度以上，則不管施加多大壓力，氣體也不

41、會(huì)液化。在臨界溫度和臨界壓力以上，物質(zhì)是以超臨界流體狀態(tài)存在。即在超臨界狀態(tài)下，隨溫度、壓力的升降，流體的密度會(huì)變化。此時(shí)的物質(zhì)既不是氣體也不是液體，卻始終保持為流體。臨界溫度通常高于物質(zhì)的沸點(diǎn)和三相點(diǎn)。,,（2）超臨界流體的特性 超臨界流體具有對(duì)于分離極其有利的物理性質(zhì)。它們的這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。超臨界流體的擴(kuò)散系數(shù)和粘度接近于氣相色譜，因此溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以獲得快速高效分離。另一方面，其密度與液相色譜

42、類似，這樣就便于在較低溫度下分離和分析熱不穩(wěn)定性、相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)。另外，超臨界流體的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，如擴(kuò)散、粘度和溶劑力等，都是密度的函數(shù)。因此，只要改變流體的密度，就可以改變流體的性質(zhì)，從類似氣體到類似液體，無(wú)需通過(guò)氣液平衡曲線。超臨界流體色譜中的程序升密度相當(dāng)于氣相色譜中程序升溫度和液相色譜中的梯度淋洗。 通常作為超臨界流體色譜流動(dòng)相的一些物質(zhì)，其物理性質(zhì)列在表20-1中。,二．超臨界流體色譜儀,1985年出現(xiàn)

43、第一臺(tái)商品型的超臨界流體色譜儀。很多部分類似于高效液相色譜儀，但有兩點(diǎn)重要差別： （l）具有一根恒溫的色譜柱。這點(diǎn)類似氣相色譜中的色譜柱，目的是為了提供對(duì)流動(dòng)相的精確溫度控制。 （2）帶有一個(gè)限流器（或稱反壓裝置）。目的用以對(duì)柱維持一個(gè)合適的壓力，并且通過(guò)它使流體轉(zhuǎn)換為氣體后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)量。實(shí)際上，可把限流器看作柱末端延伸部分。,1.Berger p7500超臨界流體色譜儀,2.流程圖,3．壓力效

44、應(yīng),在SCF中，壓力的變化對(duì)容量因子k產(chǎn)生顯著影響，由于以超流體作為流動(dòng)相，它的密度隨壓力增加而增加，而密度的增加引起流動(dòng)相溶劑效率的提高，同時(shí)可縮短淋 洗時(shí)間。例如，采用CO2流體作流動(dòng)相，當(dāng)壓力由7.O×106Pa增加到9．0×106Pa時(shí)，對(duì)于十六碳烷烴的淋洗時(shí)間可由25min縮短到5min。在SFC中，通過(guò)程序升壓實(shí)現(xiàn)了流體的程序升密，達(dá)到改善分離的目的。,程序升壓與等壓譜圖比較,4.固定相和流動(dòng)相,用

45、于SFC中的色譜柱可以是填充柱也可以是毛細(xì)管柱，目前，毛細(xì)管超臨界流體色譜（CSFC）由于具有特別高的分離效率，倍受人們的青睞。 在SFC中，最廣泛使用的流動(dòng)相要算是CO2流體，它無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒、易獲取并且價(jià)廉，對(duì)各類有機(jī)分子都是一種極好的溶劑。它在紫外區(qū)是透明的；臨界溫度31℃，臨界壓力7.29×106Pa；在色譜分離中，CO2流體允許對(duì)溫度、壓力有寬的選擇范圍。有時(shí)可在流體中引入1%～10%甲醇，

46、以改進(jìn)分離的選擇因子α值。除CO2流體外，可作流動(dòng)相的還有乙烷、戊烷、氨、氧化亞氮、二氯二氟甲烷、二乙基醚和四氫呋喃等。,5.檢測(cè)器,在高效液相色譜儀中經(jīng)常采用的檢測(cè)器，如紫外、熒光、火焰光度等都能在SFC儀中很好應(yīng)用。但SFC比起HPLC還具有一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是可采用GC中火焰離子化檢測(cè)器（FID）。我們知道，F(xiàn)ID對(duì)一般有機(jī)物分析具有較高的靈敏度，這也就提高了SFC對(duì)有機(jī)物測(cè)定的靈敏.,三．超臨界流體色譜法與其他色譜法比較,（l）與高效

47、液相色譜法比較 實(shí)驗(yàn)證明SFC法的柱效一般比HPLC法要高：當(dāng)平均線速度為0.6cm·S-1時(shí)，SFC法的柱效可為HPLC法的3倍左右，在最小板高下載氣線速度是4倍左右；因此SFC法的分離時(shí)間也比HPLC法短。這是由于流體的低粘度使其流動(dòng)速度比HPLC法快，有利于縮短分離時(shí)間。 （2）與氣相色譜法比較 出于流體的擴(kuò)散系數(shù)與粘度介于氣體和液體之間，因此SFC的譜帶展寬比GC要??；另外，SFC中流動(dòng)相的作用類似LC中

48、流動(dòng)相，流體作流動(dòng)相不僅載帶溶質(zhì)移動(dòng)，而且與溶質(zhì)會(huì)產(chǎn)生相互作用力，參與選擇競(jìng)爭(zhēng)。還有，如果我們把溶質(zhì)分子溶解在超臨界流體看作類似于揮發(fā)，這樣，大分子物質(zhì)的分壓很大，因此可應(yīng)用比GC低得多的溫度，實(shí)現(xiàn)對(duì)大分子物質(zhì)、熱不穩(wěn)定性化合物、高聚物等的有效分離。,(3)HPLC與SFC范氏曲線比較,下圖描繪了SFC與其他色譜方法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量范圍的比較。由圖看出SFC比起GC法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量的范圍要大出好幾個(gè)數(shù)量級(jí)，基本與LC法相當(dāng)。當(dāng)然，尺

49、寸排阻色譜法（SEC）所測(cè)分子質(zhì)量范圍是所有色譜法中最大的。 超臨界流體色譜法被廣泛應(yīng)用于天然物、藥物、表面活性劑、高聚物、多聚物、農(nóng)藥、炸藥和火箭推進(jìn)劑等物質(zhì)的分離和分析。,（4）應(yīng)用范圍的比較,四.超臨界流體色譜的應(yīng)用 application of SFC,1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m× 63μm i.d. 毛細(xì)管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動(dòng)相：CO2