高效液相色譜法的主要類(lèi)型及其分離原理

1、高效液相色譜法的主要類(lèi)型及其分離原理高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9107Pa）色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn)）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。特點(diǎn)1高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱(chēng)為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓

2、。一般可達(dá)150～350105Pa。2.高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)1～10mlmin。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h。3.高效：近來(lái)研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)1011g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升。5.適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖

3、具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大于400以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%～80%）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來(lái)進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分

4、析的約占70～80%。高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類(lèi)型。用不同類(lèi)型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。高效液相色譜法的主要類(lèi)型及其分離原理根據(jù)分離機(jī)制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類(lèi)型：1液—

5、液分配色譜法(LiquidliquidPartitionChromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(ChemicallyBondedPhaseChromatography)流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于下式：式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；cm溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度；Vs—固定相的體積；Vm—流動(dòng)相的體積。

6、LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對(duì)K影響不大，LLPC流動(dòng)相對(duì)K影響較大。a.正相液—液分配色譜法(NmalPhaseliquidChromatography):流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。b.反相液—液分配色譜法(ReversePhaseliquidChromatography):流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。c.液—液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要

7、求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。以陰離子交換樹(shù)脂（ROH）作固定相，分離陰離子（如Br）為例。當(dāng)待測(cè)陰離子Br隨流動(dòng)相（NaOH）進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換

8、反應(yīng)的逆過(guò)程）：抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)：RHNaOH===RNaH2ORHNaBr===RNaHBr可見(jiàn)，通過(guò)抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸HBr，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測(cè)。離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽(yáng)離子分析。6空間排阻色譜法(StericExclusionChromatography)空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類(lèi)似于分子篩的作用，但凝膠的孔

9、徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)

10、、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。1進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。2輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l47～44X107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的