高效液相色譜法及其在藥物分析中的應(yīng)用　

1、高效液相色譜法及其在藥物分析中的應(yīng)用 高效液相色譜法及其在藥物分析中的應(yīng)用 更新時(shí)間：2010-10-22 11:56:10 摘要：以液體為流動(dòng)相的色譜法稱(chēng)為液相色譜法。用常壓輸送流動(dòng)相的方法為經(jīng)典液相色譜法，這種色譜法的柱效能低、分離周期長(zhǎng)。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng) HPLC）是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種色譜方法。與經(jīng)典的液相色譜法相比，高效液相

2、色譜法具有下列主要優(yōu)點(diǎn)：①應(yīng)用了顆粒極細(xì)（一般為 10µm 以下）、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；②采用高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，一般試樣的分析需數(shù)分鐘，復(fù)雜試樣分析在數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成；③廣泛使用了高靈敏檢測(cè)器，大大提高了靈敏度。目前，已經(jīng)發(fā)展了多種不同的固定相，有多種不同的分離模式，使高效液相色譜法的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。下面介紹高效液相色譜法的有關(guān)知識(shí)，新的方法和技術(shù)以及在藥物分析中的應(yīng)用。一、分類(lèi)高

3、效液相色譜法按分離機(jī)理的不同可分為以下幾類(lèi)：(一)吸附色譜法（adsorption chromatography）以吸附劑為固定相的色譜方法稱(chēng)為吸附色譜法。使用最多的吸附色譜固定相是硅膠，流動(dòng)相一般使用一種或多種有機(jī)溶劑的混合溶劑。在吸附色譜中，不同的組分因和固定相吸附力的不同而被分離。組分的極性越大、固定相的吸附力越強(qiáng)，則保留時(shí)間越長(zhǎng)。流動(dòng)相的極性越大，洗脫力越強(qiáng)，則組分的保留時(shí)間越短。(二)液-液分配色譜法（liquid- liq

4、uid chromatography)液-液分配色譜的固定相和流動(dòng)相是互不相溶的兩種溶劑，分離時(shí)，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數(shù)（K)的不同而被分離。目前廣泛使用的化學(xué)鍵合固定相是將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上而制成的，使用化學(xué)鍵合固定相的色譜方法（簡(jiǎn)稱(chēng)鍵合相色譜法）可以用分配色譜的原理加以解釋。鍵合相色譜法在 HPLC 中占有極其重要的地位，是應(yīng)用最廣的色譜法。按照固定相和流動(dòng)相極性的不同，分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩

5、類(lèi)。1.正相色譜法（normal phase chromatography)固定相極性大于流動(dòng)相極性的分配色譜法稱(chēng)為正相分配色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)為正相色譜法。氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學(xué)鍵合固定相是正相色譜常用的固定相，正相色譜的流動(dòng)相一般為極性較小的有機(jī)溶劑。在正相色譜中，極性小的組分由于 K 值較小先流出，極性較大的組分后流出。正相色譜法用于溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)的分離。2.反相色譜法（reversed phas

6、e chromatography）流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法稱(chēng)為反相分配色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相，最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠，還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動(dòng)相常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因 K 值較小先流出色譜柱，極性較小的組分后流出。流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例增加，流動(dòng)相極性減小，洗脫力增強(qiáng)。反相色譜法是目前應(yīng)用最廣的高效液相色譜法。(三)離子交換色譜

7、法(ion exchange chromatography)離子對(duì)交換色譜法是以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親和力的不同而被分離。柱填料含有極性可離子化的基團(tuán)，如羧酸、磺酸或季銨離子，在合適的 PH 值下，這些基團(tuán)將解離，吸引相反電荷的物質(zhì)。由于離子型物質(zhì)能與柱填料反應(yīng)，所以可被分離。三個(gè)作用力，其中一個(gè)要有立體選擇性，可以是吸引的，也可以是排斥的。這就是“三點(diǎn)相互作用”理論。如果對(duì)映體中某一種對(duì)映體正好與此三個(gè)作用

8、點(diǎn)配對(duì)，相互作用較強(qiáng)，保留時(shí)間就長(zhǎng)。而另一種對(duì)映體因空間構(gòu)型不同，不能完全配對(duì)，作用相對(duì)較弱，保留時(shí)間就短，從而可以得到分離。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。l.1 常用的手性固定相有以下幾種。(1) Pirkle 型手性固定相Pickle 型手性固定相是由美國(guó)學(xué)者 Pirkle 主持研制的，主要有π-堿性（斥電子基）手性固定相和π-酸性（吸電子基）手性固定相。在分離的過(guò)程中，化合物與

9、固定相之間發(fā)生π-π電荷轉(zhuǎn)移相互作用，此類(lèi)固定相為電荷轉(zhuǎn)移型手性固定相。(2) 蛋白質(zhì)類(lèi)手性因定相蛋白質(zhì)是由手性亞基團(tuán)氨基酸組成的大分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相是將蛋白質(zhì)通過(guò)氨基酸鍵合到硅膠上而制成的。常用的蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相有牛血清蛋白（RSA）和人血 a1-酸性糖蛋白（AGP）的手性固定相，商品有 Chiral AGP，Resolvosil， Enantio Pac 等。蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相應(yīng)用范圍較廣，效果良好，但該類(lèi)固定相的譜柱容

10、量較小。常用洗脫系統(tǒng)是磷酸鹽緩沖溶液（PH4～7），離子強(qiáng)度為 0～500mmol，有機(jī)改性劑不得超過(guò) 5%。用蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相拆分酸性和堿性傾倒物對(duì)映體時(shí)，流動(dòng)相內(nèi)可分別加少量離子對(duì)試劑，如 N，N-二甲基辛胺，叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結(jié)果。(3)多糖類(lèi)手性固定相多糖類(lèi)手性固定相中應(yīng)用最多的是環(huán)糊精。環(huán)糊精（cyclodextrin, CD)是一類(lèi)環(huán)形寡聚糖，為手性高分子物質(zhì)，。根據(jù)分子中葡萄糖單元的個(gè)數(shù)不同，環(huán)糊精可

11、分為α、β、γ三類(lèi)，他們分別由 6、7、8 個(gè)D-吡喃葡萄糖組成，將 CD 分別通過(guò)硅烷鏈連接在硅膠表面就構(gòu)成環(huán)糊精手性固定相。環(huán)糊精分子成錐桶狀，內(nèi)腔的直徑由組成環(huán)糊精的葡萄糖個(gè)數(shù)決定，如常用的β-環(huán)糊精由 7 個(gè)葡萄糖分子組成，內(nèi)腔直徑為 0.8nm。用環(huán)糊精手性固定相進(jìn)行分離時(shí)，首先要求被拆分的組分進(jìn)人洞穴，形成包合物，保留時(shí)間以組分能否進(jìn)人洞穴及其緊密的程度而定，環(huán)糊精環(huán)上還有多個(gè)手性中心，能選擇性地; 與對(duì)映體作用，從而導(dǎo)致對(duì)

12、映異構(gòu)體的保留不同而被分離。如用β-環(huán)糊精手性固定相已經(jīng)成功地分離了二茂鐵等金屬有機(jī)絡(luò)合物、氨基酸以及生物堿等。除環(huán)糊精外，多糖類(lèi)的手性固定相還可以用纖維素、直鏈淀粉作成，如纖維素三醋酸醋手性固定相、纖維素三苯甲酸醋手性固定相和纖維素氨基甲酸酯手性固定相等。(4)冠醚（Grown ether）類(lèi)手性固定相冠醚與環(huán)糊精類(lèi)似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚鍵的環(huán)狀化合物，呈王冠狀結(jié)構(gòu)，外層是親脂性的乙撐基，環(huán)的內(nèi)層是富電子的雜原子，如氧、氮