蛋白折疊液相色譜法用于對(duì)還原變性牛胰島素折疊行為的研究.pdf

1、高效液相色譜不僅用于生物大分子的分離，也是蛋白折疊研究的重要手段，已發(fā)展成為蛋白折疊液相色譜法。本文利用疏水色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜分別對(duì)還原變性牛胰島素進(jìn)行了折疊研究，采用反相色譜、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI—TOF MS)及光譜學(xué)方法對(duì)折疊后的組分進(jìn)行分離和檢測(cè)。 本文在綜述部分對(duì)蛋白復(fù)性的原理、蛋白復(fù)性的方法進(jìn)行了闡述和比較，以及LC對(duì)蛋白復(fù)性的貢獻(xiàn)和二硫鍵的折疊研究方面的進(jìn)展做了全面的概述，并

2、簡(jiǎn)要介紹了本研究的目的及研究策略。 首先利用疏水色譜法(HIC)對(duì)還原變性牛胰島素的折疊行為進(jìn)行了研究，詳細(xì)研究了流動(dòng)相中脲濃度、谷胱甘肽氧化還原劑對(duì)對(duì)還原變性胰島素折疊行為的影響。發(fā)現(xiàn)復(fù)性流動(dòng)相中加入低濃度的脲能夠有效抑制還原變性胰島素的聚集沉淀，而GSH/GSSG的加入能夠參與二硫鍵的對(duì)接反應(yīng)。但是通過(guò)MALDI—TOF MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，由于GSH、GSSG修飾到胰島素的兩條多肽鏈上，使胰島素鏈間二硫鍵的對(duì)接反應(yīng)受到了影響，復(fù)

3、性效率提高不明顯。通過(guò)脲濃度及GSH/GSSG條件的優(yōu)化，還原變性胰島素復(fù)性后的質(zhì)量回收率從普通流動(dòng)相時(shí)的零提高到3.5％。另外，研究了不同疏水強(qiáng)度的疏水柱(疏水端基分別為PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000)對(duì)還原變性牛胰島素復(fù)性的影響，以疏水強(qiáng)度適中的PEG-600效果最好。最后對(duì)還原變性牛胰島素在HIC色譜上的動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)表明還原變性胰島素在柱子上的停留時(shí)間對(duì)其折疊行為有影

4、響，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)性效率有所提高，但效果不明顯。 然后利用離子交換色譜法(IEC)對(duì)還原變性牛胰島素的折疊行為進(jìn)行了研究，采用弱陰離子交換色譜法(WAX)對(duì)還原變性胰島素的折疊行為進(jìn)行了研究?？疾炝肆鲃?dòng)相中脲濃度、不同氧化還原體系( GSH/GSSG、Cyst/GSSG、Cyst)及不同氧化還原劑對(duì)的濃度比率對(duì)還原變性胰島素復(fù)性的影響。當(dāng)流動(dòng)相中添加3 mol/L的脲以及濃度比例為6：1的Cyst/GSSG時(shí)，還原變性胰島素

5、的復(fù)性效果最好，質(zhì)量回收率達(dá)到了10.6％。另外，本章還研究了WAX采用線性脲梯度洗脫的方式時(shí)對(duì)還原變性胰島素折疊的影響。通過(guò)不同梯度的選擇，復(fù)性后胰島素的質(zhì)量回收率提高到了13.3％。最后，同時(shí)采用氧化還原劑及脲梯度對(duì)IEC復(fù)性還原變性胰島素進(jìn)行了研究，質(zhì)量回收率進(jìn)一步提高，此時(shí)達(dá)到了15.6％，并且通過(guò)質(zhì)譜與光譜的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在此過(guò)程中形成了分子量與天然胰島素相同但是RPLC上保留時(shí)間不同的穩(wěn)定的中間體，此中間體的質(zhì)量回收率為17.9

6、％，所以在此條件下，胰島素二硫鍵的正確對(duì)接率達(dá)到了33.5％。 最后，利用了體積排阻色譜法(SEC)對(duì)還原變性牛胰島素的折疊行為進(jìn)行了研究，首先對(duì)非氧化型流動(dòng)相的SEC法和氧化型流動(dòng)相的SEC法復(fù)性還原變性胰島素分別進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)非氧化型SEC幾乎不能使還原變性胰島素得到復(fù)性，而添加了濃度比為6：1的Cyst/GSSG后，還原變性胰島素復(fù)性后的質(zhì)量回收率達(dá)到了4.2％。此外，利用氧化型流動(dòng)相脲梯度凝膠過(guò)濾復(fù)性方法對(duì)還原變性胰島

7、素的復(fù)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)胰島素的復(fù)性效率并沒(méi)有明顯提高，大量的胰島素A鏈和B鏈分別與流動(dòng)相中的小分子結(jié)合，使復(fù)性回收率的提高受到了限制。在本章中還對(duì)以上三種不同的蛋白折疊液相色譜法復(fù)性還原變性胰島素進(jìn)行了比較，以IEC法效果最佳，而HIC的效果是最差的。并對(duì)導(dǎo)致胰島素復(fù)性效率低的原因做了比較詳細(xì)的討論。 本文分別利用疏水色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜分別對(duì)還原變性牛胰島素的折疊行為進(jìn)行了研究，并考察了多種影響因素對(duì)其二硫鍵正確

8、對(duì)接的影響。如流動(dòng)相中的脲濃度、固定相、不同氧化還原體系、動(dòng)力學(xué)影響、脲梯度等。利用弱陰離子交換色譜法在最優(yōu)化條件下可使還原變性牛胰島素的二硫鍵對(duì)接率由2.6％提高到33.5％。本研究還為還原變性的雙鏈蛋白的折疊建立了一種新的檢測(cè)方法，尤其是對(duì)于生物活性檢測(cè)受到限制的蛋白，利用MALDI—TOF MS檢測(cè)其分子量，便能得出雙鏈蛋白鏈間的二硫鍵是否配對(duì)，再結(jié)合光譜法即可判斷出折疊后的蛋白是否恢復(fù)到了其天然態(tài)構(gòu)象。這種檢測(cè)方法既具有操作簡(jiǎn)單