類彈性蛋白多肽融合犬干擾素的表達(dá)、純化和活性檢測(cè).pdf

1、干擾素(interferon，IFN)是一類具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用的細(xì)胞因子，其中犬重組α干擾素已廣泛應(yīng)用于犬病毒性疾病的治療，并獲得良好的治療效果。但現(xiàn)有的重組α干擾素多以組氨酸標(biāo)簽融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體表達(dá)并經(jīng)過變性、復(fù)性和層析純化的方式制備。此方法制備的重組α干擾素不僅價(jià)格高，且體內(nèi)半衰期短。延長干擾素體內(nèi)半衰期的常見方式有聚乙二醇化和與血清白蛋白等蛋白標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，前者反應(yīng)條件和產(chǎn)品質(zhì)量控制困難，后者仍然需

2、要使用親和層析等成本較高的方法純化。類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)是一類由五個(gè)氨基酸組成的聚合物，具有溫度敏感的可逆相變特性，可用離心等簡單方法分離純化，已被用作重組蛋白的純化標(biāo)簽。另外，由于良好的生物相容性，ELP還被用作體內(nèi)藥物載體，以起緩釋和延長半衰期的作用。
　　犬IL-29(CaIL-29)抗病毒作用有別于CaIFN-α，目前尚無基因工程產(chǎn)品上市。犬γ干擾素(CaIFN-γ)除

3、具有抗病毒作用，還有免疫調(diào)節(jié)作用。本研究用PCR擴(kuò)增CaIL-29和CaIFNα1成熟肽編碼序列，將其分別插入ELP融合表達(dá)載體pET-ELP，獲得重組表達(dá)載體pCaIL29-ELP和pELP-CaIFNα。再將合成的CaIFN-γ成熟肽序列插入pELP-CaIFNα中，獲得CaIFN-α與CaIFN-γ融合表達(dá)載體pELP-CaIFNαγ。分別將重組載體轉(zhuǎn)化BLR(DE3)和BL21(DE3)大腸桿菌，在37℃用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表

4、達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示:pCaIL29-ELP、pELP-CaIFNα和pELP-CaIFNαγ重組菌均表達(dá)預(yù)期大小的融合蛋白，其中CaIL29-ELP融合蛋白為不溶性包涵體，ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ為可溶性表達(dá)。然后在優(yōu)化條件下進(jìn)行CaIL29-ELP融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示在低于26℃條件下為可溶性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，CaIL29-ELP、pELP-

5、CaIFNα和ELP-CaIFNαγ的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.2mM IPTG、24℃和24h。
　　分別在優(yōu)化條件下進(jìn)行CaIL29-ELP、ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)純化融合蛋白的相變溫度、鹽濃度等相變循環(huán)(ITC)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示CaIL29-ELP、ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ的相變溫度分別為26℃、26℃和39℃，最佳氯化鈉濃度分別為3mol/L、3mol/L和3mol

6、/L。純化融合蛋白用6mol/L尿素溶解，透析后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示CaIL29-ELP融合蛋白的純度為74％，濃度為0.08mg/mL;ELP-CaIFNα融合蛋白的純度為79％，濃度為0.14mg/mL;ELP-CaIFNαγ融合蛋白的純度為82％，濃度為0.13mg/mL。以MDCK/VSV系統(tǒng)進(jìn)行干擾素活性檢測(cè)，結(jié)果顯示CaIL29-ELP的抗病毒活性為2.5×104U/mg，ELP-CaIFNα的抗病毒效價(jià)為1.