抗重組VP28囊膜蛋白單克隆抗體的制備及在對蝦白斑綜合征病毒檢測中的應用.pdf

1、對蝦白斑綜合征(WSS)是全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)所面臨的危害最大,傳播最廣的病害之一,至今已席卷了整個世界的對蝦養(yǎng)殖地區(qū),造成了巨大的經(jīng)濟損失。但目前尚無良好有效的防治手段,因此早期檢測和預防WSS成為近年來的研究熱點。本研究主要克隆、表達了其病原對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28,并用純化的重組蛋白免疫小鼠制備了單克隆抗體(單抗),同時對制備的單抗在wssv檢測中的應用進行了初步探索,研究結果將為對蝦自然感染W(wǎng)SSV狀況檢測和監(jiān)

2、測提供技術支撐,對了解病毒的感染與傳播,進而控制該病毒的繼續(xù)蔓延有重要的意義,研究內(nèi)容和結果如下:1)采用改良的差速離心法從人工感染W(wǎng)SS的克氏原螯蝦中分離純化了WSSV。完整的病毒外包被著囊膜,長約300～400nm,直徑約100～120 nm。失去囊膜剩下的核衣殼呈螺旋圓柱體形,長約300～450 nm,直徑約80～90 nm。純化的病毒形態(tài)和大小與先前報道的結果相似。2)以純化病毒基因組為模板,通過特定引物的設計,利用PCR擴增技

3、術,克隆得到了完整的WSSV囊膜蛋白VP28基因,把該VP28基因在大腸桿菌中進行表達并用Ni-NTA柱純化后,分別用SDS-PAGE和Western Blot進行蛋白鑒定。結果顯示表達產(chǎn)物均出現(xiàn)了與預測大小一致特異性條帶,表明VP28基因成功在大腸桿菌中進行了有效表達。3)利用純化的重組VP28蛋白作為抗原免疫Balb/c小白鼠,將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合,篩選獲得陽性雜交瘤細胞,并克隆了能穩(wěn)定分泌強陽性單克隆抗體的一株雜交瘤

4、細胞株anti-rVP28 MAb。通過ELISA和免疫電鏡對單抗的特異性進行了分析,結果表明所制得的單抗可以特異性地與WSSV上的VP28蛋白結合,說明用重組VP28蛋白抗原刺激篩選得到的單抗能識別天然的VP28蛋白表位,可用于WSSV的檢測。4)通過Dot-blotting對WSSV進行快速的檢測試驗,發(fā)現(xiàn)anti-rVP28 MAb能有效地檢測WSSV。競爭性PCR結果表明anti-rVP28 MAb檢測WSSV的極限為病毒量10