對(duì)蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白基因克隆、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物抗病效果的研究.pdf

1、該研究以中國(guó)對(duì)蝦為材料,從病蝦組織中分離出白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,簡(jiǎn)稱WSSV)野生毒株(暫時(shí)命名為浙江株,WSSV-ZJ),以該病毒基因組為模板,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增了WSSV-ZJ的囊膜蛋白VP28和VP19的基因,分別采用大腸桿菌和桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了這兩個(gè)基因的表達(dá)研究,并初步試驗(yàn)了蠶蛹表達(dá)產(chǎn)物在螯蝦抗對(duì)蝦白斑綜合征(WSS)的效果.主要研究結(jié)果如下:1.2001年5月從浙江省象

2、山縣某對(duì)蝦養(yǎng)殖塘采集患白斑病的中國(guó)對(duì)蝦,用WSSV的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物克氏原螯蝦(Cambarus proclarkii)作了動(dòng)物回歸試驗(yàn),試驗(yàn)蝦在3~10天內(nèi)幾乎全部死亡;用蔗糖密度梯度法純化的病毒在電鏡下的大小、形態(tài)特征與WSSV極為相似(完整的病毒粒子大小約100×400nm,核衣殼大小約60×350nm);以該病毒基因組DNA為模板,應(yīng)用PCR技術(shù),擴(kuò)增出了WSSV的特異性條帶,從而從病毒的致病性、形態(tài)特征和特異性DNA片段等方面證實(shí)

3、了分離獲得的病毒是對(duì)蝦白斑綜合征病毒.2.利用PCR技術(shù),擴(kuò)增獲得了病毒的兩個(gè)囊膜蛋白基因,基因序列全長(zhǎng)分別為615bp和366bp,編碼的氨基酸殘基數(shù)分別為204和121,它們與GenBank中登錄的WSSV囊膜蛋白VP28和VP19基因的同源性均在99﹪以上,而與其它病毒DNA片段的同源性則很低.3.將克隆到的vp28、vp19基因通過(guò)適當(dāng)?shù)拿盖泻蟛迦氲奖磉_(dá)載體pET30a的多克隆位點(diǎn)中,獲得重組質(zhì)粒pET30a- vp28和pET

4、30a- vp19.將它們導(dǎo)入E.coli.BL21中,在37℃下,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后,用SDS-PAGE和Western blotting進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)vp28基因的表達(dá)產(chǎn)物均出現(xiàn)了明顯的特異性條帶,其融合表達(dá)產(chǎn)物的大小與預(yù)測(cè)的一致,而在vp19基因均未見(jiàn)表達(dá)產(chǎn)物的特異性條帶.4.為了獲得與天然vp28、vp19結(jié)構(gòu)與活性較一致的表達(dá)產(chǎn)物,該研究采用了表達(dá)產(chǎn)物后加工較完善的桿狀病毒-家蠶表達(dá)系統(tǒng).5.將含量組WSSV囊膜蛋白的