豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白重組抗原及單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、PRRSV是引起豬繁殖與呼吸障礙綜合征的主要病原,其分為兩個血清型:美洲型和歐洲型。美洲型自1995年底以來一直在中國內陸流行,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。2011年田克恭等報道在中國大陸首次發(fā)現(xiàn)歐洲型PRRSV。如何對PRRSV及時有效的鑒定,是減少經(jīng)濟損失,保護畜牧業(yè)健康有序發(fā)展的前提。由于單克隆抗體較高的靈敏性和特異性,以及其相關操作簡單、廉價等特點,所以利用單克隆抗體的診斷方法在疾病的檢測中得到廣泛的應用。本課題開展了能夠同時識別

2、美洲型和歐洲型PRRSV的雜交瘤細胞株的制備及鑒定,為后續(xù)檢測試劑盒的研發(fā)做好鋪墊。
　　 本實驗利用實驗室保存的美洲型PRRSV HPBEDV毒株成功克隆出ORF7基因,并將其成功連接到原核表達載體pET-30a(+)上,轉化到BL21(DE3)后進行誘導表達?？扇苄苑治霰砻髟吮磉_的融合蛋白是以包涵體的形式存在,復性后western boltting檢測證明其具有較好的抗原性。利用Ni2+-NTA樹脂親和層析純化后的融合蛋白

3、經(jīng)三次免疫和一次加強免疫Balb／c小鼠后進行融合,經(jīng)過四次亞克隆和間接ELISA的篩選,最終獲得了兩株單抗(NA N002和NA N008)。間接ELISA檢測證明2株雜交瘤細胞所分泌的McAb特異性良好,并具有較高的穩(wěn)定性?？贵w亞型均為1gG2b。雜交瘤細胞的染色體數(shù)目為100和105,腹水純化后只有抗體的重鏈和輕鏈兩條鏈,大小分別為50ku和25ku?？贵w效價:NA N002為1:40960,NA N008為1:20480。特異性