豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5、M和N蛋白單克隆抗體的研制及生物學(xué)特性分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起一種以感染豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎，各種年齡豬(特別是仔豬)呼吸障礙為特征的高度傳染性疾病。豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)，與馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)、小鼠乳酸脫氫酶病毒(LDV)以及猴出血熱病毒(SHFV)，同屬尼多病毒目，動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬。PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈球形，核衣殼呈二十面體對(duì)稱，囊膜表面有明顯的纖突。PRR

2、S病毒分為兩個(gè)亞群，亞群A為歐洲原型(LV)，亞群B為美國(guó)原型(VR-2332)。PRRSV基因組全長(zhǎng)約15kb，包括9個(gè)開放閱讀框(ORF)，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)(ORFla和ORFIb)和7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(ORF2a，ORF2b，ORFs 3-7)。 本研究利用純化的PRRSV、重組N蛋白及GP5和M蛋白基因DNA分別免疫小鼠，通過細(xì)胞融合技術(shù)，以期獲得穩(wěn)定分泌抗PRRsV各主要結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株

3、。 1.抗PRRSV N蛋白單克隆抗體： 本研究用純化的PRRSV作為免疫原，腹腔注射免疫BALB／c小鼠；3周后腹腔注射等量抗原進(jìn)行二次免疫；再過2周，相同劑量腹腔注射進(jìn)行三免；一周后檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，達(dá)到要求后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3天后，取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2／0進(jìn)行融合。經(jīng)間接ELISA進(jìn)行雜交瘤篩選，共獲得2株能針對(duì)PRRSV核衣殼蛋白的特異性單抗，分別命名為488、4D8。間接ELISA法檢測(cè)無血清培養(yǎng)上清M

4、cAb效價(jià)為1：32～1.128。利用間接免疫熒光(Indirect immunofluorescent assay，IFA)檢測(cè)單抗特性，結(jié)果有特異性熒光，均成陽性。這2株單抗僅與PRRSV發(fā)生特異性反應(yīng)，與常見豬其它病毒如豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒1型以及豬圓環(huán)病毒2型均無反應(yīng)性。以表達(dá)的重組N蛋白作為檢測(cè)抗原進(jìn)行ELISA，證明該2株單抗針對(duì)的是PRRSV N蛋白。 以HIS融合表達(dá)的PRRSV重組N蛋白作為免疫原，

5、制備并建立了3株穩(wěn)定分泌針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞2F3、4D5、5D11，其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1：64～1：512，2F3小鼠腹水效價(jià)為1：12800。其中2F3的Ig亞類為IgM。ELISA結(jié)果顯示，3株均與融合表達(dá)的HIS-N蛋白反應(yīng)，而與HIS融合表達(dá)的其他蛋白不反應(yīng)。Westren-blot結(jié)果顯示其中單抗2F3針對(duì)PRRSV N蛋白線性表位，而單抗5Dll和4D5可能針對(duì)PRRSV N蛋白的構(gòu)象型

6、表位。2．抗PRRSV GP5蛋白的克隆抗體： 利用重組真核質(zhì)粒pcDNA3-GP5免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞sP2/O融合，經(jīng)間接ELISA篩選，3次有限稀釋法克隆，得到3株能穩(wěn)定分泌抗PRRSV GP5蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株。分別命名為4C9、5D10、5F12。其中5D10的Ig亞類為IgM。ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)為1：64～1：1024,腹水效價(jià)為1：3200～1：10

7、240，用IFA和IPMA檢測(cè)，結(jié)果均為陽性。經(jīng)Western-blot證明，這三株單抗均針對(duì)PRRSV的GP5蛋白。中和試驗(yàn)表明，5D10和5F12具有病毒中和活性，腹水中乖效價(jià)分別為1：40和1：80。但5D10和5F12的相對(duì)親和力不同，證明其識(shí)別不同的抗原位點(diǎn)。三株細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)20代后仍能穩(wěn)定分泌抗體。3．抗PRRSV M蛋白的單克隆抗體： 將PRRSVM蛋白的基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，利用構(gòu)建成的重組真核質(zhì)粒免

8、疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備抗PRRSV M蛋白的單抗，建立間接ELISA方法篩選陽性克隆，獲得3株可分泌特異性抗PRRSV M蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A7、4G3、5F3。IA7和403的Ig亞類為IgM。ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1：64～1：1024，腹水效價(jià)為1：3200～1：10240。同時(shí)用blot、IFA檢測(cè)，結(jié)果均是陽性。4G3和1A7相對(duì)親和力不同，證明其識(shí)別不同抗原位點(diǎn)。1A7和4G