豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）GP5蛋白跨膜區(qū)刪除對小鼠免疫效果的影響.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）GP5蛋白跨膜區(qū)刪除對小鼠免疫效果的影響姓名：陳勇軍申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：陳溥言20060601中文摘要豬繁殖與呼吸綜合癥病毒G P 5 蛋白跨膜區(qū)刪除對小鼠免疫效果的影響中文摘要根據(jù)G e n B a n k 公布的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒( P o r c i n e r e p r o d u c t i v ea n dr e s P i r a t

2、 o r ys y n d r o m ev i r u s ，P R R S V ) O R F 5 基因的核苷酸序列設(shè)計3 對特異性引物，從重組質(zhì)粒p M D 一礎(chǔ)乃中擴增去除O R F 5 基因中包括全部信號肽在內(nèi)的N端跨膜區(qū)( 2 8f e S i d u e s ) 和A 表位基因，保留B 表位基因。另外將該跨膜區(qū)和O R F 5 基因中部跨膜區(qū)( 6 0r e s i d u e s ) 同時刪除。改造后的O R F 5 基

3、因分別命名為O R F 5 - 1 和0 R F S - 2 。將2 個基因片段定向克隆到原核表達載體p E T - 3 2 a ( + ) ，構(gòu)建重組質(zhì)粒p E T - O R F 5 - 1 和p E T ～O R F 5 —2 ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)I P T G 誘導(dǎo)表述和S D S —P A G E 電泳分析，口2 F 卜1 和O R F S - 2 基因獲得融合表達，表達量分別為1

4、2 ，2 ％和3 9 ％。結(jié)果證明刪除雙跨膜區(qū)能明顯提高O R F 5 基因的表述量。經(jīng)w e s t e r n - b l o t 分析，融合蛋白具有一定的免疫學(xué)活性。表明摘除跨膜區(qū)對該蛋白的抗原性影響不大。比較豬繁殖與呼吸綜合癥病毒O R P ' 5 基因的原核表達質(zhì)粒p E T —O R F Y - - 1 和p E T 一伽肛2 在體外表達效率以及體內(nèi)的免疫效果，以期從中選出高效的豬繁殖與呼吸綜合瘟病毒亞單位疫苗。應(yīng)用

5、H i s - b i n d 樹脂層析柱純化重組G P 5 蛋白，將表達產(chǎn)物G P 5 - 1 和G P 5 - 2 純化、復(fù)性并免疫6 ～8 周齡小鼠，用間接L I S A 法、微量血清中和法與M T T 法檢測小鼠血清中特異性抗重組蛋白抗體、血清中和抗體水平以及脾臟中淋巴細(xì)胞增殖功能。結(jié)果表明G P 5 —1 和G P 5 —2 蛋白刺激機體產(chǎn)生了較高水平的抗體滴度為l ：1 6 0 0 ，但是經(jīng)微量中和試驗發(fā)現(xiàn)中和抗體均小于1

6、：4 。不過兩者均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，淋巴細(xì)胞增殖水平無顯著差異，與對照組相比差異顯著( P < O ．0 5 ) 。本研究探討了提高P R R S Ve r r 5 g e n e 表達效率的方法，并證實刪除跨膜區(qū)的G P 5 蛋白能很好的誘導(dǎo)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫，對今后深入研究P R R S V 蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能以及研制針對P R R S V 新型基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 豬繁殖與呼吸綜合癥病毒