金花茶離體再生體系的優(yōu)化及分子機(jī)制研究.pdf

1、本研究以金花茶（Camellia nitidissima Chi.）為材料，在本實(shí)驗(yàn)室以往的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行如下研究：①金花茶離體再生體系優(yōu)化，包括花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)的優(yōu)化、金花茶體胚成熟的調(diào)控與萌發(fā)研究；②金花茶體胚Cn-SERK基因cDNA和DNA克?。虎劢鸹ú梵w胚Cn-SERK基因啟動(dòng)子克??；④金花茶Cn-SERK基因啟動(dòng)子5′端不同缺失突變體載體構(gòu)建，并轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行其功能驗(yàn)證，為探討金花茶體胚發(fā)育中的Cn-SERK作用機(jī)制提供

2、參考。主要研究結(jié)果如下：
　　1、金花茶離體再生體系的優(yōu)化
　　1.1金花茶花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)的優(yōu)化
　　以金花茶花藥為材料，誘導(dǎo)其分化愈傷組織，結(jié)果表明：在4號(hào)培養(yǎng)基：2 mg/L2,4-D+0.5 mg/L KT+1 mg/L NAA+50 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高達(dá)到67.10%。誘導(dǎo)出的白色愈傷可以在分化培養(yǎng)中變綠，根據(jù)以往的研究經(jīng)驗(yàn)，可以斷定其為胚性愈傷組織。
　　

3、1.2金花茶體胚成熟的調(diào)控與萌發(fā)
　　該試驗(yàn)研究了不同濃度的ABA，不同濃度的ABA、肌醇、瓊脂、蔗糖組合，不同的光質(zhì)對(duì)體胚成熟的作用，在進(jìn)行成熟培養(yǎng)之后，轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中以體胚變紅為指示。結(jié)果表明：在經(jīng)過ABA的單因素處理后，ABA在濃度為5.0 mg/L時(shí)，處理的效果最好。在不同濃度的ABA、肌醇、瓊脂、蔗糖組合的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)體胚成熟的最佳組合為：10 mg/L ABA+100 mg/L肌醇+50 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂

4、。將體胚在紅光、藍(lán)光、綠光、白光培養(yǎng)之后，轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)只有在白光下誘導(dǎo)成熟的體胚才能變紅，在其他的單質(zhì)光中培養(yǎng)的體胚只有極少數(shù)變紅。在經(jīng)過成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)60d之后，紅色的體胚慢慢的變?yōu)榫G色或者墨綠色，在這些體胚上開始分化產(chǎn)生一些微小葉芽，莖或者是長(zhǎng)有根毛的不定根，最后葉芽伸長(zhǎng)形成小植株。
　　2、金花茶體胚Cn-SERK基因的cDNA全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析
　　以金花茶體胚為材料，采用RT-PCR以及RACE

5、方法，獲得了金花茶體胚Cn-SERK基因的cDNA全長(zhǎng)序列，GenBank登錄號(hào)為：JX123756.1。該基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，其中5′UTR長(zhǎng)度為47bp、ORF為1875bp、3′UTR為197bp、poly(A)尾巴為28bp，開放閱讀框編碼624個(gè)氨基酸，將其命名為Cn-SERK。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法分析表明：該蛋白質(zhì)具有蛋白質(zhì) N端富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域，親水、且具有信號(hào)肽的跨膜蛋白，裂解成

6、熟位點(diǎn)可能存在于25-26個(gè)氨基酸之間，跨膜結(jié)構(gòu)域有5個(gè)，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性最高，達(dá)到0.685。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)無卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，主要有α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，存在一個(gè)蛋白激酶位點(diǎn)。此蛋白可能發(fā)生絲氨酸磷酸化位點(diǎn)的有16個(gè)，酪氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)各5個(gè)。
　　3、金花茶體胚Cn-SERK基因DNA序列的克隆
　　以金花茶體胚DNA為模板，克隆得到了金花茶體胚Cn-SERK基因DNA序列，ATG和TGA分別為起始密碼子和終止

7、密碼子，該基因ORF的DNA序列全長(zhǎng)為8593bp。內(nèi)含子分析表明Cn-SERK基因由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，且每個(gè)內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)符合GT-AG規(guī)則。使用PlantCARE軟件分析內(nèi)含子序列，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)含子中含有類似啟動(dòng)子中的順式元件，且都具有核心啟動(dòng)子元件CAAT-Box。內(nèi)含子中的調(diào)控元件可能對(duì)基因的特異性表達(dá)有調(diào)控作用，可能影響轉(zhuǎn)錄的起始和延伸并且可能具備較強(qiáng)的啟動(dòng)子功能，在小麥、茶樹、老鼠、人等生物上也有類似報(bào)道。

8、>　　4、金花茶體胚Cn-SERK基因啟動(dòng)子的克隆
　　采用連接介導(dǎo)染色體步移法克隆金花茶體胚Cn-SERK基因啟動(dòng)子，得到Cn-SERK基因啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為596bp，在線預(yù)測(cè)位置336-386處為基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域，可信度達(dá)0.97，序列為：5′-AAGCAAAGCATAAAAAAGTTGCAGAGCAGATACAACAACAACCGATTAGG-3′，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)在377bp處的A。用PlantCARE軟件發(fā)現(xiàn)了該序列的一些元

9、件，其中有核心啟動(dòng)子元件TATA-Box(22處)和CAAT-Box(10處)，該序列基本可以推斷認(rèn)定為其含有基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域。與高轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)的5′UTR Py-rich stretch（3處），與厭氧反應(yīng)有關(guān)的順式作用元件ARE（1處），部分光響應(yīng)元件AT1-motif（1處），部分包含光響應(yīng)的保守DNA元件ATCC-motif（1處），真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件Box-W1（1處），MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS（1處），光響應(yīng)元件Sp1（1處），部分

10、光響應(yīng)元件I-box（1處）、TCCC-motif（1處），生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-element（1處），未知功能元件3個(gè)（5處）。
　　5、金花茶Cn-SERK基因啟動(dòng)子5′端不同缺失突變體載體構(gòu)建與功能驗(yàn)證
　　試驗(yàn)采用金花茶Cn-SERK基因5′端缺失突變啟動(dòng)子取代pCAMBI1301上的CaMV35S啟動(dòng)子，與GUS報(bào)告基因融合，構(gòu)建含GUS基因的植物表達(dá)載體，檢測(cè)其在煙草植株中的表達(dá)情況，分析影響啟動(dòng)子表達(dá)的因素，

11、最終確定啟動(dòng)子中缺失片段的功能。以克隆得到的啟動(dòng)子片段為模板，選用XbaⅠ和 NcoⅠ為缺失片段上下游的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增目的缺失片段。使用pCAMBI1301質(zhì)粒為載體，通過對(duì)質(zhì)粒的雙酶切、缺失片段與質(zhì)粒的連接，構(gòu)建Cn-SERK基因啟動(dòng)子5′端不同缺失突變體的載體，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)缺失片段已與質(zhì)粒連接。將驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，進(jìn)行PCR檢測(cè)，以帶有目片段的農(nóng)桿菌制作侵染煙草的菌液。將煙草切成0.5 cm