T-2毒素的代謝和毒作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究.pdf

1、T-2毒素由鐮刀菌(Fusarium)產(chǎn)生，是單端孢霉烯族毒素類中毒性最強(qiáng)的毒素。糧食作物，尤其小麥、大麥、燕麥和玉米是T-2毒素主要的污染對象。通過污染飼料，T-2毒素對動物和動物性食品消費(fèi)者健康造成危害。T-2毒素與核糖體結(jié)合或破壞線粒體功能來抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸的合成，通過激活MAPK、JAK/STAT等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。
　　T-2毒素的代謝途徑與毒性產(chǎn)生密切相關(guān)。T-2毒素進(jìn)入動

2、物體內(nèi)被代謝成各種產(chǎn)物，其毒性差異變化巨大。HT-2毒素、3'-OH-T-2毒素和Neosolaniol(NEO)等是T-2毒素在動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物。與T-2毒素相比，一些代謝產(chǎn)物毒性降低，但有些代謝物的毒性升高。研究清楚T-2毒素的代謝途徑和主要代謝產(chǎn)物是揭示其在動物體內(nèi)如何發(fā)揮毒性的重要前提。所以，揭示T-2毒素在動物中，尤其是食品動物中的代謝途徑，對毒性機(jī)理研究的開展和食品安全以及人類健康等方面至關(guān)重要。然而，迄今為止，人們尚

3、未清楚T-2毒素在食品動物中的整體代謝特點(diǎn)，尤其是不同種屬動物對T-2毒素代謝轉(zhuǎn)化存在著何種異同，尚無系統(tǒng)研究。
　　T-2毒素引起核糖體和線粒體的損傷并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與T-2毒素迅速激活MAPK信號通路密切相關(guān)。MAPK被證明是單端孢霉烯族毒素發(fā)揮細(xì)胞毒性的重要信號通路之一。MAPK的激活迅速而短暫，但與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的炎性細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α和IL-1β等的激活卻是持續(xù)而緩慢的，所以MAPK通路下游很可能存在其

4、它信號通路激活炎性因子。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)初步發(fā)現(xiàn)JAK/STAT是單端孢霉烯族毒素的下游信號通路之一，并與毒素的免疫毒性密切相關(guān)。然而，目前與T-2毒素毒性密切相關(guān)的MAPK和JAK/STAT信號通路的上下游關(guān)系仍是未知，兩者的激活場所在哪里？哪些因子連接兩者的傳遞？尚未有報(bào)道。
　　已有研究表明肝臟和腸道是代謝單端孢霉烯族毒素的主要場所。所以，本課題系統(tǒng)研究了T-2毒素在豬、雞、魚和大鼠肝微粒體、肝胞液以及肝細(xì)胞中的代謝情況

5、。包括分析鑒定主要的代謝產(chǎn)物，討論主要的代謝途徑以及種屬間代謝的異同。此外，為進(jìn)一步完善T-2毒素在動物體內(nèi)的代謝，本文以豬為例探討了T-2毒素在豬盲腸道模型中的代謝和降解情況，從而與肝臟的代謝相呼應(yīng)。在毒性機(jī)理研究上，本研究著重從T-2毒素作用后MAPK和JAK/STAT信號通路的相互交聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系，以及某些重要基因和蛋白的功能去揭示T-2毒素細(xì)胞毒性的潛在毒性機(jī)理。為此，本研究通過信號通路特異性抑制劑、免疫熒光/激光共聚焦和透射電鏡等

6、方法和手段研究了MAPK和JAK/STAT信號通路的交聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系，毒素的胞內(nèi)毒性靶標(biāo)，并深入探討了JNK1和STAT3交聯(lián)關(guān)系和功能。本研究對于尋找毒素的毒性化合物和殘留標(biāo)示物提供了重要的靶標(biāo)信息，對闡釋動物對毒素的耐受性機(jī)理、毒素的防控和人類以及動物疾病的預(yù)防有重要意義。毒作用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究也對深入認(rèn)識T-2毒素的毒理機(jī)制以及信號在胞內(nèi)外傳遞并行使功能研究有重要參考價(jià)值。
　　1.T-2毒素在動物肝臟中比較代謝研究
　　本研

7、究首先制備了豬、雞、大鼠、鯉和草魚肝微粒體、肝胞液和肝細(xì)胞，加入NADPH生產(chǎn)系統(tǒng)，在37℃(魚28℃)下與T-2毒素孵育2h后，樣品經(jīng)過沉淀蛋白、高速離心和過濾膜等前處理過程，采用HPLC-MS-IT-TOF檢測鑒定代謝物，探討T-2毒素在動物肝臟中的代謝途徑，比較T-2毒素在不同動物種屬間代謝的異同。
　　結(jié)果表明，T-2毒素在肝微粒體中主要被代謝成5種產(chǎn)物(MT1-5)，分別為HT-2毒素(MT1)、Neosolaniol(

8、NEO)(MT2)、3'-OH-T-2毒素(MT3)、3'-OH-HT-2毒素(MT4)和T-2triol(MT5)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)T-2毒素原形。在豬和雞中發(fā)現(xiàn)HT-2毒素(MT1)、NEO(MT2)、3'-OH-T-2毒素(MT3)和3'-OH-HT-2毒素(MT4)。大鼠肝微粒體中除發(fā)現(xiàn)上述4種代謝物外，還檢測到T-2triol，證明大鼠肝臟代謝T-2毒素能力強(qiáng)于其他動物。與陸地動物顯著不同，水生動物鯉肝微粒體中只檢測到HT-2毒素、

9、NEO、3'-OH-T-2毒素和微量3'-OH-HT-2毒素代謝物。草魚中檢測到3'-OH-T-2和3'-OH-HT-2毒素，但并未檢測到HT-2毒素。3'-OH-T-2毒素和NEO是魚類的主要代謝產(chǎn)物。陸地動物（豬、雞和大鼠）生成HT-2毒素的相對含量比魚類顯著高（p＜0.05），但3'-OH-T-2的含量比魚類顯著低（p＜0.05）。可見，水解反應(yīng)生成HT-2毒素是陸地動物肝臟微粒體的主要代謝方式，羥基化反應(yīng)是魚類肝臟代謝T-2毒素

10、的主要方式。
　　肝胞液中發(fā)現(xiàn)了HT-2毒素(MT1)、NEO(MT2)和3'-OH-T-2毒素(MT3)，但并未發(fā)現(xiàn)3'-OH-HT-2毒素，且3'-OH-T-2毒素的相對含量也非常低。鯉中未發(fā)現(xiàn)羥基化代謝物，因此肝胞液中代謝酶的羥基化能力低于肝微粒體。
　　豬、雞和大鼠肝細(xì)胞中，除T-2毒素外，均發(fā)現(xiàn)了水解代謝產(chǎn)物HT-2毒素和NEO，且HT-2毒素所占的比例高于NEO。豬代謝產(chǎn)生HT-2毒素能力最強(qiáng)，雞最弱。肝細(xì)胞中未

11、發(fā)現(xiàn)羥基化代謝物。
　　上述研究表明，T-2毒素在動物肝臟中的代謝存在相似性和差異性。水解(生成HT-2毒素、NEO和T-2 triol)和羥基化(3'-OH-T-2和3'-OH-HT-2)是T-2毒素在動物肝臟中的主要代謝方式。豬、雞和大鼠中常見代謝物HT-2毒素在草魚和鯉肝臟中很少產(chǎn)生，魚類中3'-OH-T-2占主導(dǎo)地位。水解生成HT-2毒素是陸地動物豬、雞和大鼠的共同主要代謝途徑，而魚類中羥基化是主要的代謝方式，表明魚類對T

12、-2毒素的代謝與陸地動物存在較大差異。魚類和陸地動物肝臟中CYP450單加氧酶和羧酸酯酶的種類，以及對羥基化和水解催化能力的差異可能是造成T-2毒素代謝途徑不同的重要原因。本研究進(jìn)一步完善了T-2毒素在肝臟中的代謝機(jī)制，對T-2毒素的殘留監(jiān)控和殘留標(biāo)示物的確定以及毒理機(jī)制研究具有重要的指導(dǎo)意義。
　　2.T-2毒素在豬盲腸模型中代謝和降解研究
　　將T-2毒素與來自1頭豬的盲腸內(nèi)容物(Cecum)在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)20min、

13、40min、1h、2h、4h、8h和24h，采用槲皮素(Quercetin)檢測微生物的正?；钚裕囼?yàn)重復(fù)4頭豬(Cecum 1-4)。樣品通過QuEChERS方法進(jìn)行前處理，采用Agilent1100 HPLC串聯(lián)API4000 QTrap質(zhì)譜定量T-2毒素的降解和代謝物。潛在代謝物的鑒定采用精確質(zhì)譜Thermo HPLC串聯(lián)LTQ Orbitrap XL-HESI檢測。本研究與肝臟的數(shù)據(jù)結(jié)合，將更好的揭示T-2毒素的代謝途徑和生物利

14、用度。
　　與盲腸Cecum4降解T-2毒素能力相比，來自另外3頭豬盲腸(Cecum 1-3)微生物降解T-2毒素的能力顯著低(p＜0.05)。在盲腸Cecum 1-3中，T-2毒素降解在31.1-45.9％之間。而在盲腸Cecum4中，T-2毒素降解迅速，8h后T-2毒素剩余26.6±0.6％，24h后僅有3.0±0.1％的T-2毒素被檢測到。所以來自不同豬的盲腸對T-2毒素的降解存在很大個(gè)體差異性。
　　孵育24h后代謝

15、物除HT-2毒素外，未檢測到其它代謝物。在盲腸Cecum4中，孵育8h后HT-2毒素并未進(jìn)一步降解代謝，但在24h時(shí)間點(diǎn)相對低的回收率可能預(yù)示著HT-2毒素被代謝成其它化合物，但生成的量低于HPLC-MS/MS儀器的最低檢測限(LOD)。T-2毒素對豬的毒性很有可能是由T-2和HT-2毒素的混合毒性造成。盲腸孵育中代謝物只發(fā)現(xiàn)了HT-2毒素，其他脫環(huán)氧等代謝物均未發(fā)現(xiàn)。因此，當(dāng)研究T-2毒素的毒性時(shí)，HT-2毒素的機(jī)體吸收也不容忽視。當(dāng)

16、T-2毒素到達(dá)大腸后，代謝成HT-2毒素也可被機(jī)體吸收并造成危害。T-2毒素在盲腸中的代謝和降解研究，進(jìn)一步補(bǔ)充了肝臟中的代謝數(shù)據(jù)，豐富了T-2毒素的肝腸代謝信息，為T-2毒素的體內(nèi)代謝和毒性研究提供重要參考。
　　3.T-2毒素介導(dǎo)的MAPK和JAK/STAT信號通路交聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究
　　為深入研究T-2毒素介導(dǎo)的MAPK和JAK/STAT信號通路之間的交聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系，將T-2毒素(14nM)與RAW264.7細(xì)胞共同孵育不同時(shí)

17、間(0.5、1、2、4、8、12和24h)，通過信號通路特異性抑制劑研究信號通路中JNK、ERK、p38/MAPK和JAK、STAT之間的相互轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系，此外還關(guān)注了連接兩個(gè)信號通路之間可能的結(jié)點(diǎn)，并通過透射電鏡觀測了胞內(nèi)細(xì)胞器在T-2毒素影響下超顯微結(jié)構(gòu)病變，尋找T-2毒素胞內(nèi)潛在的毒性靶標(biāo)，從而為分子毒理研究提供更直觀的證據(jù)。通過特異性抑制劑、免疫熒光/激光共聚焦和流式細(xì)胞儀等方法和手段，本文初步探討了JNK和STAT基因的功能。最后

18、，關(guān)注了T-2毒素的毒性與胞內(nèi)代謝和濃度的相關(guān)關(guān)系。
　　研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERK、JNK1和p38 MAPK基因能夠被T-2毒素在1-2h內(nèi)迅速激活，隨后又快速沉寂，說明MAPK為一個(gè)快速反應(yīng)通道。JAK2和STAT3基因被T-2毒素激活后并上調(diào)，但與MAPK信號通路不同，JAK/STAT信號通路激活過程緩慢，在12h才出現(xiàn)顯著的上調(diào)。因此，在RAW264.7細(xì)胞中JAK/STAT是MAPK通路的一個(gè)下游通路，可能傳遞著來自MAPK

19、的信號。IL-6在眾多炎性細(xì)胞因子中基因上調(diào)最為顯著，2h后上調(diào)30.43倍，12h后上調(diào)48.47倍。因此，IL-6在MAPK和JAK/STAT的信號傳遞中，可能發(fā)揮中至關(guān)重要的作用。
　　為更好的研究信號通路之間的上下游關(guān)系，通過相應(yīng)的特異性抑制劑干預(yù)，觀測其他基因及其蛋白磷酸化的表達(dá)。加入JNK1特異性抑制劑SP600125后，T-2毒素誘導(dǎo)的JAK2、ERK1/2和K-Ras的基因表達(dá)均受到顯著抑制（p＜0.05）。STA

20、T3 mRNA表達(dá)活性也受到顯著抑制(p＜0.05)，但STAT1 mRNA并未出現(xiàn)顯著抑制效應(yīng)。T-2毒素誘導(dǎo)IL-6基因表達(dá)在12h出現(xiàn)了顯著的抑制（p＜0.05）。T-2毒素激活JNK1后，信號通過JAK2傳導(dǎo)，隨后通過STAT3傳遞，其中IL-6和K-Ras在MAPK和JAK/STAT信號通路中發(fā)揮著紐帶傳遞作用。阻斷JNK1活性后，CIS、SOCS1和SOCS2基因顯著上調(diào)表達(dá)（p＜0.05），說明JNK1對此SOCS的3個(gè)亞

21、家族進(jìn)行負(fù)調(diào)控，但阻斷JNK1后SOCS3基因下調(diào)，表明JNK1對SOCS3為正調(diào)控關(guān)系。
　　RAW264.7細(xì)胞中T-2毒素誘導(dǎo)后，JNK1信號經(jīng)JAK2、STAT3、ERK和p38傳導(dǎo)，激活的JAK2、STAT3、ERK和p38基因又可調(diào)控JNK1基因表達(dá)。阻斷STAT3表達(dá)后，T-2毒素誘導(dǎo)的IL-6基因在12h受到顯著抑制(p＜0.05)。綜合研究結(jié)果，IL-6激活JAK2/STAT3通路后，STAT3又可繼續(xù)激活I(lǐng)L-

22、6后續(xù)基因表達(dá)，進(jìn)入下一循環(huán)，繼續(xù)發(fā)揮作用。
　　經(jīng)T-2毒素誘導(dǎo)后JNK1蛋白迅速磷酸化，并在1h開始轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，隨后會從核內(nèi)返回胞質(zhì)，但仍會繼續(xù)進(jìn)入核內(nèi)。T-2毒素引起的p-JNK1穿梭入核至少持續(xù)12h。阻斷JNK1活性后，STAT3磷酸化和入核均受到抑制，但STAT1未受影響。表明RAW264.7細(xì)胞中，T-2毒素誘導(dǎo)的STAT3磷酸化和入核發(fā)揮功能均受JNK1調(diào)控。
　　透射電鏡觀測結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞

23、與T-2毒素(14nM)孵育12h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體腫大、核質(zhì)邊緣化，表明細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡癥狀。28nMT-2毒素作用細(xì)胞12h后，核質(zhì)完全邊緣化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張甚至形成空泡，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體出現(xiàn)脫粒，出現(xiàn)嚴(yán)重凋亡癥狀。觀測結(jié)果表明T-2毒素主要作用于核糖體和線粒體。
　　阻斷JNK1表達(dá)后，線粒體出現(xiàn)了明顯腫脹，細(xì)胞凋亡率顯著上升，基因Bcl-2/Bax和Bcl-xL/Bax比值均出現(xiàn)顯著下降（p＜0.05），Cas

24、pase-3和Caspase-9基因水平顯著上調(diào)，凋亡數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)病變，表明JNK1具有保護(hù)RAW264.7細(xì)胞線粒體功能。阻斷STAT3活性后，Bcl-2/Bax和Bcl-xL/Bax比值也出現(xiàn)明顯下調(diào)(p＜0.05)，進(jìn)一步證明JNK1-STAT3為一條細(xì)胞保護(hù)通路，此通路可能通過保護(hù)線粒體的正常功能來抑制T-2毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另一方面，本研究也證明T-2毒素是一把雙刃劍，具有兩面性，這一點(diǎn)也進(jìn)一步豐富了對T-

25、2毒素細(xì)胞毒性機(jī)理的認(rèn)識。
　　液相質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示，在12h時(shí)細(xì)胞內(nèi)T-2毒素含量顯著高于2h時(shí)的含量。電鏡超顯微結(jié)構(gòu)也觀測到12h時(shí)細(xì)胞受損比2h時(shí)更加嚴(yán)重，表明T-2毒素長時(shí)間接觸RAW264.7細(xì)胞，對其產(chǎn)生更高的毒性。2h后檢測到的代謝物有HT-2毒素和3'-OH-T-2毒素，12h為3'-OH-T-2毒素，但含量甚低，T-2毒素始終是細(xì)胞內(nèi)主要的毒性物質(zhì)。
　　RAW264.7細(xì)胞中T-2毒素刺激后，MAPK和J

26、AK/STAT信號通路之間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的交聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系。本研究揭示了IL-6和K-Ras在連接MAPK和JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要功能。JNK1-STAT3信號通路受T-2毒素刺激后發(fā)揮了保護(hù)線粒體，抑制細(xì)胞凋亡的功能。T-2毒素激活凋亡通路的同時(shí)，也能激活細(xì)胞的保護(hù)通路，抑制細(xì)胞的凋亡。T-2毒素靶向性損害RAW264.7細(xì)胞的線粒體和核糖體。T-2毒素進(jìn)入細(xì)胞后，雖被代謝成多種物質(zhì)，但T-2毒素仍占主導(dǎo)地位調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。